本研究成果由Livia Piatti, Alina Batzilla, Fumio Nakaki, Hannah Fleckenstein, Francois Korbmacher, Rory K. M. Long, Daniel Schraivogel, John A. Hawkins, Tais Romero-Urunuela, Borja Lopez-Gutiérrez, Silvia Sanz Sender, Yannick Schwab, Lars M. Steinmetz, James Sharpe & Maria Bernabeu共同完成，并以"Plasmodium falciparum egress disrupts endothelial junctions and activates JAK-STAT signaling in a microvascular 3D blood-brain barrier model"为题，于2025年8月在线发表在《Nature Communications》期刊上。

技术原理
本研究核心技术的独特机制在于构建了一个高度仿生的三维微血管系统。该技术通过软光刻和注射成型相结合的方法，在I型胶原水凝胶中预图案化生成微流控13×13网格网络，创造了复杂的微流体通道结构。

关键技术原理包含三个创新点：首先采用多细胞共培养策略，将原代人星形胶质细胞和脑血管周细胞预先种植在胶原溶液中，形成支持基质，而后在原代人大脑微血管内皮细胞在重力驱动流下接种到微流控网络中，形成完整的三维结构；其次利用先进的光学成像技术进行质量验证，通过共聚焦显微镜对特异性标志物（PECAM-1、vWF、VE-cadherin用于内皮细胞，PDGFRβ、NG2用于周细胞，GFAP、S100B、AQP4用于星形胶质细胞）进行成像，确认各种细胞的正确定位和形态特征；第三是建立功能评估体系，通过70 kDa FITC-葡聚糖通透性实验定量评估屏障完整性，证明该模型相比内皮细胞单独培养模型具有显著降低的通透性（2.15×10⁻⁶ cm/s vs 8.31×10⁻⁶ cm/s），证实其增强的屏障特性。

重要发现
01三维血脑屏障模型的构建与优越的屏障特性
研究团队成功构建了一个更接近人体真实生理状态的生物工程化3D微血管模型。该模型在I型胶原水凝胶中制造，通过软光刻和注射成型技术预图案化形成一个微流控网络。将原代人星形胶质细胞和脑血管周细胞预先种植在胶原溶液中，再将原代人脑微血管内皮细胞在重力驱动流下接种到微流控网络中，从而形成了一个三维共培养体系。经过免疫荧光染色鉴定，三种细胞均表达了其特有的标志物：内皮细胞表达PECAM-1、vWF、VE-cadherin和β-catenin；周细胞表达PDGFRβ和NG2；星形胶质细胞则表达GFAP、S100B和AQP4。共聚焦显微镜成像显示，内皮细胞形成了可灌注的微血管，并被星形胶质细胞和周细胞包裹，再现了体内BBB的三维结构和架构。

该模型的关键优势在于其显著增强的屏障功能。定量RT-PCR测量显示，与星形胶质细胞和周细胞以7:3比例共培养后，内皮细胞中BBB特异性标志物的表达随时间增加，包括紧密连接标志物（OCLN, CLDNs）、BBB转运蛋白（LRP1, SLC家族）和外排泵（PGP, ABC家族），并在培养7天后达到峰值。功能实验证明，含有周细胞和星形胶质细胞的3D-BBB模型对70 kDa FITC-葡聚糖的通透性显著降低，其通透性值（2.15x10⁻⁶ cm/s）显著低于仅含内皮细胞的模型（8.31x10⁻⁶ cm/s）。这种增强的屏障特性为研究恶性疟原虫诱导的血管屏障破坏机制提供了独特而可靠的平台。

scRNA-seq分析揭示了暴露于iRBC-逸出介质后，三种细胞类型的转录谱发生了转变。内皮细胞的差异基因表达分析显示，多个对BBB完整性至关重要的基因表达显著降低，包括紧密连接基因CLDN5（Claudin-5）、TJP1（ZO-1）和粘附连接转录本CDH5（VE-cadherin）。基因本体（GO-term）富集分析表明，内皮细胞中大多数下调的转录本与内皮细胞连接和粘附、细胞骨架组织、血管发育、DNA修复、染色质组织和Wnt信号传导有关。

这些转录变化直接导致了形态和功能的改变。透射电镜（TEM）分析显示，虽然完整细胞接触区域的紧密连接长度没有显著差异，但暴露于iRBC-逸出介质的3D-BBB微血管中，超结构间隙的百分比显著更高。共聚焦显微镜观察也证实了这一点，VE-cadherin染色显示出改变的粘附连接模式，表现为连接染色变细和大规模的内皮间缝隙形成。功能上，经过24小时处理后，3D-BBB微血管对70 kDa FITC-葡聚糖的微血管通透性比率显著增加了6.5倍。这些结果强有力地表明，恶性疟原虫-iRBC产物降低了紧密连接和粘附连接标志物的表达，改变了细胞间连接的形态，并导致了血管屏障完整性的功能损害。

上调的转录本包括参与I型干扰素（IFN）反应的基因，如IFIT基因家族成员（IFIT1, IFIT2, IFIT3）、干扰素刺激基因（ISGs）（如ISG15, ISG20）和其他IFN诱导基因（如MX1, IFI6, IFI27, OAS1），以及ferroptosis基因（如HMOX1）。此外，JAK-STAT家族的信号转导子（STAT1, STAT2, JAK2）及其一些相互作用蛋白的转录本也被上调。

抗原呈递是一个在所有BBB组成细胞中强烈 elevated 的重要炎症相关过程。TEM证据显示内皮细胞存在摄取寄生虫物质的迹象，形成了含有iRBC膜或hemozoin的大空泡。免疫荧光染色显示寄生虫核酸与溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）共定位，表明寄生虫物质被运送到了内皮细胞的溶酶体区室。团队进一步定义了抗原呈递的转录组基因特征（MHC I类和MHC II类转录本）。内皮细胞和星形胶质细胞均表现出MHC I类基因特征的强劲上调，而MHC II类抗原呈递基因特征（与CD4+ T细胞招募相关）也在内皮细胞中强烈上调，在星形胶质细胞和周细胞中适度上调。

为了更深入了解信号通路的变化，团队使用了PROGENy计算方法来基于下游基因表达推断信号通路活性。结果与GO-term分析一致，观察到NFkB和TNFα信号在内皮细胞和周细胞中的增加。值得注意的是，JAK-STAT通路在所有细胞类型中均被激活。通过免疫荧光染色对STAT1的验证表明，与对照组相比，暴露于寄生虫逸出产物后，3D-BBB模型中STAT1表达增加，且不仅发生在于内皮细胞，也发生在胶原水凝胶中的支持周细胞和星形胶质细胞中，表明模型对iRBC-逸出介质产生了整体反应。在2D单层细胞中进一步评估了STAT1向核的易位，作为通路活性增加的代理指标，发现内皮细胞核STAT1定位增加。

更重要的是，这些形态学上的改善与3D-BBB屏障功能的改善相关。通过70 kDa FITC-葡聚糖灌注评估微血管通透性发现，虽然Ruxolitinib在对照组中仅 modestly 改善了基线通透性，但其在病理条件下的影响更为显著。与iRBC-逸出介质共同孵育导致微血管通透性比单独使用iRBC-逸出介质条件降低了近24倍。这些结果凸显了JAK-STAT通路在恶性疟原虫介导的屏障破坏中的重要性，并支持了Ruxolitinib在减少与脑疟疾相关的脑血管功能障碍方面的治疗潜力。

挑战与展望
当前三维血脑屏障模型虽显著优于传统模型，但仍面临多项临床转化障碍。模型构建复杂且需要经验丰富的实验室进行长期培训，限制了其广泛推广；尽管屏障特性有所改善，但与原生理通透率仍有差距，这主要与原代内皮细胞中紧密连接蛋白如Claudin-5和Occludin的固有低表达有关。

未来研究方向应聚焦于技术优化与创新，包括采用诱导多能干细胞（iPSC）来源的脑内皮细胞提升屏障性能，但需解决其上皮样特性问题，通过过表达ETV2、FLI1、ERG等ETS因子或FOXF2和ZIC3等转录因子可改善血管表型；模型复杂性也需进一步增强，引入小胶质细胞、神经元等其他脑细胞类型，以及免疫细胞和血流剪切力等生理因素，以更全面模拟体内环境。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Piatti L, Batzilla A, Nakaki F, Fleckenstein H, Korbmacher F, Long RKM, Schraivogel D, Hawkins JA, Romero-Uruñuela T, López-Gutiérrez B, Sanz Sender S, Schwab Y, Steinmetz LM, Sharpe J, Bernabeu M. Plasmodium falciparum egress disrupts endothelial junctions and activates JAK-STAT signaling in a microvascular 3D blood-brain barrier model. Nat Commun. 2025 Aug 6;16(1):7262. 

DOI:10.1038/s41467-025-62514-2.