文献解读：胃癌患者免疫细胞的单细胞转录组测序
2023-02-21 来源:伯豪生物 点击次数:787
期刊： Aging 5.59
测序技术：单细胞转录组测序
导语
胃癌预后相对较差。单细胞转录组测序能够在单细胞水平上对高度复杂的肿瘤微环境中的细胞群体进行特异性分析，从而揭示了未表征的分子复杂性。在这项研究中，使用单细胞转录组测序在单细胞水平上表征了从胃癌患者分离的T细胞的异质性。鉴定了不同的免疫细胞亚型及其异质转录因子，并描绘了它们的发育轨迹。特别是对CD8+细胞和Tregs，相较于对照组，来自胃癌组织的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中的IRF8转录因子下调。针对CD8+耗竭型T细胞和Treg细胞进行的多种分析为胃癌的免疫治疗提供理论基础。
方法
根据单细胞转录组测序数据胃癌患者中分离的T细胞异质性，确定了不同的免疫细胞亚型及其异质转录因子，并对不同细胞亚群中的不同基因进行分析，为胃癌中免疫细胞的靶向治疗提供理论基础。
结果结论
借助单细胞测序对胃癌组织，胃癌患者外周血的免疫细胞以及对照组免疫细胞进行测序，使用UMAP法降维可视化后，根据特异表达基因将细胞注释为特定的免疫细胞。之后针对不同的免疫细胞进行差异基因的分析，功能通路分析以及特定基因的分析。这些发现为胃癌靶向免疫治疗提供了理论基础，可作为研究免疫细胞基本特征并潜在指导免疫治疗。
研究结果
1. 从胃癌样品和免疫细胞聚类中获取scRNA-seq图谱
从9个样本中分离的免疫细胞进行了scRNA-seq，其中包括两个健康人的两个外周血样本、三个胃癌患者术前的三个外周血样本，以及两对胃癌组织和癌旁组织样本。根据细胞的分子和功能特点对其进行分类，确定了组织中的10个细胞簇和外周血中的9个细胞簇（图1A）。接下来，确定了每个免疫细胞亚型及其异质转录因子。图1B显示了它们的发展轨迹（图1B）。同时确认了一些基因的表达，并分析了其与临床特征的相关性（图1C）
2.与正常样品相比，胃癌样品中耗竭型CD8+T细胞中的IRF8下调
为揭示CD8+T细胞的内在结构和潜在功能亚型，包括初始型，细胞毒性型和耗竭型CD8+T细胞，我们分别分析了T与N组和PB与HB组中的基因，并制作了热图和火山图（图2A、2B）。重点分析了耗竭型CD8+T细胞在胃癌中的优先富集。途径分析表明，肿瘤浸润耗竭型CD8+T细胞中的这些不同基因可能参与细胞因子的产生（图2C）。在轨迹分支方面，我们观察到它始于细胞毒性CD8+T细胞，结束于胃癌组织中耗竭型CD8+T淋巴细胞（图2D），最后以耗竭型CD8+T细胞在血液中结束（图2E），这与肿瘤的正常过程一致。我们评估了来自11个胃癌患者肿瘤的肿瘤浸润CD8+耗竭T细胞和CD8+TIL中干扰素调节因子8（IRF8）转录因子的表达，发现与正常组织相比，IRF8在两种组织中均下调（图2F）。此外，在最初诊断时分析了32名胃癌患者的外周血单核细胞（PBMC），以使用流式细胞术评估CD8+T细胞中的IRF8表达（图2G）。根据癌症基因组图谱（TCGA）的胃癌数据，IRF8下调与总生存期（OS）缩短相关（图2H）。Open Targets软件显示，IRF8在免疫系统的细胞中发挥负调节作用（图2I）。
3. 胃癌中与Treg功能唯一相关的基因的鉴定
IFIT2、CCL3、RBPJ等上调，而IGJ、XCL1、XCL2等下调（图3A）。途径表明它们富含细胞因子-细胞因子-受体相互作用、PI3K-AKT和NF-kB途径（图3B，3C）。对于轨迹分支，我们在肿瘤环境中观察到更少的效应器Treg，但在胃癌组织中观察到更明显的初始型（图3D）。我们强调了胃癌中差异表达的一些膜受体、转录因子和细胞因子。转录因子RBPJ在肿瘤浸润Tregs中过度表达（图3E）。使用S在肿瘤浸润Tregs中，我们发现与相邻正常组织相比，胃癌组织中TRING的交互网络分析显示，RBPJ参与了NOTCH途径（图3F）。为了探索可能调节RBPJ表达的潜在网络，我们分析了可能促进或抑制RBPJ基因转录的TFs。我们使用Cistrome DB Toolkit发现前20个TF在癌症组织中差异表达（图3H）。我们发现RBPJ可能是促进胃癌中LAG3和GEPIA2表达的TF（图3I）。
4. B细胞的基因标记和胃癌中的通路分析
癌组织和癌旁组织B细胞亚群中差异表达的基因由EIF1AY、KRT19、LCN2、RPS4Y1等组成（图4A）。在PB与HB组中，RORA、COL6A2、ETS1、FHIT等高表达，而HBA2、HBA1、IGLL5、C1CB等下调（图4B）。分析显示，B细胞亚群中上调的基因分散在TNF、NOD样和CXCR趋化因子受体结合途径中（图4C，4D）。热图分析结果表明，B细胞通过产生细胞因子（包括IFNG、CCL3、IL-8等）发挥免疫调节功能。
5. NK细胞对胃癌反应时分泌的更多的抑制性受体和更少的激活性受体
NK细胞是先天免疫的重要组成部分，由于其释放细胞因子的能力和介导对肿瘤细胞的细胞溶解活性，在宿主防御中发挥关键作用。与相邻正常组织相比，胃癌组织中IL8、G0S2、HSPA6、CXCL1等上调，而IGJ、TFF1、NCR2等下调（图5A）。在PB与HB组中，SCAF1、LAG3、TPM1等高表达（图5B）。途径分析表明，这些基因可能参与细胞因子-细胞因子-受体相互作用、MAPK信号传导、趋化因子信号传导和T细胞受体信号传导（图5C，5D）。与对照组相比，NK细胞在胃癌组织中表达了更多的抑制性受体，如KIR2DL2。同样，与对照组相比，NK细胞在胃癌患者血液中表达较少的活化受体，如KLRK1和CD226。最后，NK细胞在胃癌中分泌更多的细胞因子，包括CCL3和CCL4（图5E，5F）。这些数据表明NK细胞积极参与免疫监测以预防胃癌。
参考文献：
Single-cell RNA sequencing of immune cells in gastric cancer patients 2020; 12(3): 2747-2763. doi: 10.18632/aging.102774.