研究结果
1. 皮肤细胞的单细胞表达谱
本研究对未经治疗的4例AD患者和5例HC健康人的前肘窝处进行抽吸起泡处理，对吸出疱液的上清进行蛋白质组多重分析，并将疱液和酶消化的疱顶(即表皮)的细胞进行混合，用于流式细胞分选（CD45+/CD45-）和scRNA 测序。另外对4例AD患者和2例HC健康样本的皮肤进行活检，对活检后的样本流式分选（CD45+/CD45-）后进行scRNA-seq，用作对照（图1A）。对过滤后的抽吸起泡和活检的细胞，进行聚类以及通过marker基因定义，共鉴定出24（C0-C23）种不同的细胞类型（图1 B-S）。
 

图1

2. 比较抽吸起泡和活检分离的细胞类型图谱
通过比较AD皮肤活检(图2 A-B)与AD和HC抽吸起泡样本(图2 C-F)获得的细胞，发现大多数细胞群在3组中都存在。另外活检组织中鉴定的4个T细胞和5个DC簇也存在于抽吸起泡样本(图2C-D)中，而HCs (图2E-F)中增殖T细胞( Tcell-3 )、DC-1至DC-3和pDC群的频率较低，与AD的炎症本质一致，具有较高的免疫细胞数量。
 

图2

3. 活检与抽吸起泡样本中基因表达的差异
接下来，研究比较了活检和抽吸起泡样本的HC组和AD组的差异基因。总体而言，无论是HC抽疱和HC活检，还是AD抽疱和AD活检，大多数基因在抽疱和活检样本中表现出相似的表达（图3A）。但是结构角蛋白在AD和HC样本中显示出相似的表达，而炎症角蛋白（KRT16/KRT6A）在HC样本(图3B-C)中显示出相当弱的表达，这与在非炎症环境中炎症相关介质的表达一致。在AD慢性病变中经典上调的其他炎症标志物中，如TH1相关的( IFNG ) (图3E)、TH2相关的( IL4R、IL5、IL13)(图3F-H)和TH22相关的标志物( IL22 ) (图3J)，在AD样本中的表达强于HC样本，这与之前的研究一致。相比之下，TH17激活的标记物（IL17A）（图3I）和CCL20在抽吸起泡AD中明显低于活检样本。总的来说，这些数据表明，在抽疱样本中可以捕捉到AD典型的TH2 / TH22相关炎症细胞因子表达情况。
 

图3

4. 抽吸起泡样本中AD与HC差异基因比较
为了进一步揭示抽吸起泡样本中AD和HC样本之间的基因表达差异，研究在热图中展示了10个上调基因和下调基因。上调的基因包括前面提到的TH亚群相关细胞因子IL13和IL22，它们在T细胞中具有相当异质性的表达(图4A，橙色框)，也包括CD4和CD8A在亚群中的表达（图4B,C）。AD在T cell-2中GZMB和NKG7表达增加，在TREG中IL2RA和TNFRSF4表达增加(图4B-C)。除KC (KC-5, KC-6)外，TCELL-3簇中增殖标志物高表达，AD比HC中表达水平有升高趋势。AD和HC中的T细胞均为组织常驻记忆标记CD69阳性(图4D)，如前所述，调节性T细胞水平最低。在DC和巨噬细胞中，一些炎症标志物如RNASE1、LYZ和CCL17(图4A，绿框，E-G)在AD中强烈上调，以及EGFR配体双调节蛋白(AREG)(图4H)，促进KC增殖。除DC外，AD中KCs(图4A，蓝框)和T细胞中AREG也增加。
 

图4

5. AD样本中的T细胞类型
接下来对T细胞进行了亚群聚类并进行了分组间的比较，T细胞被分为了9个亚群，但并不是所有的细胞都表达CD3D（图5A-B）。其中簇(0、2、3和4)的标记基因分别对应于T cell-1、TREG、T cell-2和T cell-3。其中C1代表静态记忆T细胞，C0包含激活的记忆T细胞，其效应功能由促炎细胞因子的活跃产生介导，如TH2和Th22相关的介质IL13和IL22，以及Th17相关的细胞因子IL26(图5C-E)，尽管IL17表达低到缺失。细胞毒性CD8+T细胞主要存在于表达IFNG(图5F)和GZMB的C3中。
 

图5

6. 蛋白质组学水疱液分析补充了单细胞转录组学，揭示了多个DC相关标记物的上调
本研究对8名AD患者和8名HC患者(包括接受scRNA-seq的患者)的疱液进行了蛋白质组学分析，补充了细胞scRNA-seq数据。研究使用炎症、免疫和神经学panel进行了Olink多重检测，其中包含368个已建立的探索性生物标志物。图6A展示了8例AD和8例HC样本中olink检测蛋白的归一化表达，大多数AD样本表现出一些表达水平的增加，但在样本之间存在相当大的异质性。在AD和HC样品中，有42种蛋白存在显著差异(FDR<0.05)(图6B)。为了将检测到的疱液蛋白质分配到特定的细胞类型，绘制了Olink疱液scRNA检测中与蛋白质丰度差异相对应的基因热图。该分析显示了27个标记物，如图6C所示，大多数标记物在由DC和巨噬细胞组成的髓系细胞室中发现。这些基因包括表皮增生介质(AREG, EREG)，病原体模式识别受体(CLEC7A)，细胞因子受体(CSF2RA)，与TH2免疫相关的细胞因子(CCL13)，参与组织重塑和细胞外基质降解的标记(CDH3, PLAU)，以及在成熟DC上特别表达的共刺激分子(CD40, TNFRSF9) (DC-3)。其他类型的细胞仅表现出某些介质的微弱或部分上调，包括黑色素细胞的CXCL1，一些T细胞的TNFSF11，以及一些KCs的IL18和CXADR（图6D-L）。
 

图6

结论
这些数据表明，通过使用scRNA-seq技术，抽吸起泡比传统活检具有几个优势，包括更好的皮肤细胞转录组分辨率，结合间质液的蛋白质组学信息，揭示塑造AD细胞和蛋白质组学微环境的新型炎症因子。

参考文献：
Rojahn T B, Vorstandlechner V, Krausgruber T, et al. Single-cell transcriptomics combined with interstitial fluid proteomics defines cell type–specific immune regulation in atopic dermatitis[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2020, 146(5): 1056-1069.