高通量RNA测序（RNA-seq）的基础原理与技术参数
2025-10-28 来源:本站 点击次数:58
高通量 RNA 测序（RNA-seq）
1. 核心基础概念
1.1 转录组
转录组是指在特定生理或实验条件下，单个细胞、组织或个体产生的所有转录产物的集合。广义转录组涵盖 mRNA、rRNA、tRNA 及非编码 RNA；狭义转录组特指所有 mRNA 的集合，在未额外说明的实际研究中，转录组通常默认指代 mRNA。转录组可反映样本的整体基因表达水平，因此也被称为表达谱，常用基因芯片和 RNA-seq 技术开展研究。
Q1：广义转录组与狭义转录组的核心区别是什么？
A1：核心区别在于包含的转录产物范围，广义转录组涵盖 mRNA、rRNA、tRNA 及非编码 RNA，狭义转录组仅包含 mRNA，实际研究中默认指代狭义转录组。
Q2：研究转录组的主要技术手段有哪些？
A2：主要技术手段包括基因芯片技术和 RNA-seq 技术，其中 RNA-seq 作为高通量测序技术，在转录本检测和基因表达分析中应用广泛。
1.2 转录本
所有从基因转录生成的 RNA 分子均称为转录本。不同细胞（如肌肉细胞、神经细胞）虽含相同 DNA 序列，但因开放表达的基因不同，产生的转录本及后续蛋白质存在差异。转录本分为两类：一类是可被核糖体翻译为蛋白质的 mRNA；另一类是无法翻译为蛋白质、自身具备功能的非编码 RNA（ncRNA），如 rRNA、tRNA、siRNA 等。
Q1：转录本的分类依据是什么？
A1：分类依据是能否被翻译为蛋白质，可翻译为蛋白质的是 mRNA，无法翻译且自身有功能的是非编码 RNA（ncRNA）。
Q2：不同细胞类型转录本存在差异的原因是什么？
A2：原因是不同细胞中开放表达的基因不同，即使 DNA 序列一致，基因表达的选择性导致转录本种类和数量存在差异。
1.3 转录本产生过程
转录本的产生以 DNA 为模板，具体过程分为两步：
DNA 中的基因片段先转录生成 pre-mRNA，该阶段生成的 pre-mRNA 包含未翻译区域（UTRs）、开放阅读框（ORF）及内含子序列；
转录后加工阶段，pre-mRNA 中的内含子被去除，同时在 RNA 的 5’端添加帽子结构、3’端添加聚腺苷酸尾巴（polyA 尾），最终形成可翻译为蛋白质的成熟 mRNA 转录本。
其中，mRNA 的 5’帽子结构和 3’polyA 尾具有保护 RNA 免受核酸酶降解、调控转录后修饰、参与核转运、影响 RNA 稳定性及翻译效率等功能；非编码 RNA 通常不具备这两种结构。
Q1：pre-mRNA 加工为成熟 mRNA 的关键步骤是什么？
A1：关键步骤包括内含子去除、5’端添加帽子结构、3’端添加 polyA 尾，这三个步骤共同保障 mRNA 的功能和稳定性。
Q2：mRNA 的 5’帽子结构和 3’polyA 尾的核心作用是什么？
A2：核心作用包括保护 mRNA 不被核酸酶降解、调控转录后修饰与核转运过程、维持 mRNA 稳定性及调控翻译效率，对 mRNA 的生物学功能至关重要。
2. RNA-seq 关键技术参数
2.1 测序深度（Sequencing depth）
测序深度又称 “乘数”，是指测序过程中样本中每个碱基被检测到的平均次数，是衡量测序数据量的核心参数，通常用 “X” 表示（如 100X 代表平均每个碱基被测序 100 次）。其计算逻辑为测序获得的总有效数据量与目标基因组（或转录组）大小的比值。
Q1：测序深度的单位 “X” 代表什么含义？
A1：“X” 代表样本中每个碱基被测序的平均次数，例如 50X 即表示平均每个碱基在测序中被检测到 50 次。
Q2：计算测序深度时，分子和分母分别对应什么数据？
A2：分子是测序获得的总有效数据量，分母是目标研究对象（如基因组或转录组）的总大小，两者的比值即为测序深度。
2.2 测序覆盖度（Coverage）
测序覆盖度又称 “覆盖率”，是指测序过程中被检测到的碱基数量占目标基因组（或转录组）总碱基数量的比率，通常用百分比（%）表示。例如，对人类基因组（大小约 3G）测序后，若有 2.7G 碱基至少被 1 条读段覆盖，则测序覆盖度为 90%（2.7G/3G×100%）。
Q1：测序覆盖度与测序深度的核心区别是什么？
A1：测序覆盖度反映 “被检测到的碱基范围占比”，用百分比表示；测序深度反映 “每个碱基被检测的平均次数”，用 “X” 表示，两者分别从 “范围” 和 “次数” 描述测序效果。
Q2：若目标基因组大小为 2G，测序后有 1.8G 碱基被覆盖，其测序覆盖度是多少？
A2：测序覆盖度为 90%，计算方式为被覆盖的碱基量（1.8G）除以目标基因组大小（2G），再乘以 100%。
2.3 reads
reads 是 RNA-seq 测序的直接结果，指测序过程中仪器检测到的单条 RNA 序列片段，1 条独立的序列片段即称为 1 条 reads。这些 reads 需后续通过比对软件与参考基因组（或转录组）进行匹配，才能用于基因表达量计算、转录本结构分析等研究。
Q1：reads 在 RNA-seq 研究中的作用是什么？
A1：reads 是 RNA-seq 的原始数据基础，通过与参考基因组或转录组比对，可进一步分析基因表达水平、识别转录本结构及发现新转录本。
Q2：1 条 reads 是否等同于 1 个转录本？
A2：不等同。1 条 reads 是转录本的片段序列，1 个完整的转录本通常需要多条 reads 通过拼接或比对后才能完整呈现。
2.4 adapter（接头序列）
adapter 是 RNA-seq 文库构建过程中添加到 RNA 片段两端的短序列，具有类似引物的功能。其核心作用是协助测序仪器识别并结合 RNA 片段，保障测序反应的顺利启动，测序完成后需通过生物信息学分析去除 adapter 序列，避免其对后续数据解读产生干扰。
Q1：adapter 序列在 RNA-seq 中的核心功能是什么？
A1：核心功能是协助测序仪器识别和结合 RNA 片段，为测序反应的启动提供必要条件，是文库构建和测序过程中的关键辅助序列。
Q2：测序完成后为何需要去除 adapter 序列？
A2：因为 adapter 是人工添加的辅助序列，并非样本自身的 RNA 片段，若不去除会干扰基因表达量计算、转录本比对等后续分析，影响结果准确性。
RNA-seq 核心概念与技术参数对照表
3. 总结
RNA-seq 作为高通量测序技术，通过检测转录组中的 RNA 分子，可实现基因表达水平分析、新转录本发现及转录后修饰研究。理解转录组、转录本等基础概念，掌握测序深度、覆盖度、reads、adapter 等关键技术参数，是开展 RNA-seq 研究及解读数据结果的核心前提，为后续基因功能解析、生物过程调控机制研究提供基础支撑。
1. 核心基础概念
1.1 转录组
转录组是指在特定生理或实验条件下，单个细胞、组织或个体产生的所有转录产物的集合。广义转录组涵盖 mRNA、rRNA、tRNA 及非编码 RNA；狭义转录组特指所有 mRNA 的集合，在未额外说明的实际研究中，转录组通常默认指代 mRNA。转录组可反映样本的整体基因表达水平，因此也被称为表达谱，常用基因芯片和 RNA-seq 技术开展研究。
Q1：广义转录组与狭义转录组的核心区别是什么？
A1：核心区别在于包含的转录产物范围，广义转录组涵盖 mRNA、rRNA、tRNA 及非编码 RNA，狭义转录组仅包含 mRNA，实际研究中默认指代狭义转录组。
Q2：研究转录组的主要技术手段有哪些？
A2：主要技术手段包括基因芯片技术和 RNA-seq 技术，其中 RNA-seq 作为高通量测序技术，在转录本检测和基因表达分析中应用广泛。
1.2 转录本
所有从基因转录生成的 RNA 分子均称为转录本。不同细胞（如肌肉细胞、神经细胞）虽含相同 DNA 序列，但因开放表达的基因不同，产生的转录本及后续蛋白质存在差异。转录本分为两类：一类是可被核糖体翻译为蛋白质的 mRNA；另一类是无法翻译为蛋白质、自身具备功能的非编码 RNA（ncRNA），如 rRNA、tRNA、siRNA 等。
Q1：转录本的分类依据是什么？
A1：分类依据是能否被翻译为蛋白质，可翻译为蛋白质的是 mRNA，无法翻译且自身有功能的是非编码 RNA（ncRNA）。
Q2：不同细胞类型转录本存在差异的原因是什么？
A2：原因是不同细胞中开放表达的基因不同，即使 DNA 序列一致，基因表达的选择性导致转录本种类和数量存在差异。
1.3 转录本产生过程
转录本的产生以 DNA 为模板，具体过程分为两步：
DNA 中的基因片段先转录生成 pre-mRNA，该阶段生成的 pre-mRNA 包含未翻译区域（UTRs）、开放阅读框（ORF）及内含子序列；
转录后加工阶段，pre-mRNA 中的内含子被去除，同时在 RNA 的 5’端添加帽子结构、3’端添加聚腺苷酸尾巴（polyA 尾），最终形成可翻译为蛋白质的成熟 mRNA 转录本。
其中，mRNA 的 5’帽子结构和 3’polyA 尾具有保护 RNA 免受核酸酶降解、调控转录后修饰、参与核转运、影响 RNA 稳定性及翻译效率等功能；非编码 RNA 通常不具备这两种结构。
Q1：pre-mRNA 加工为成熟 mRNA 的关键步骤是什么？
A1：关键步骤包括内含子去除、5’端添加帽子结构、3’端添加 polyA 尾，这三个步骤共同保障 mRNA 的功能和稳定性。
Q2：mRNA 的 5’帽子结构和 3’polyA 尾的核心作用是什么？
A2：核心作用包括保护 mRNA 不被核酸酶降解、调控转录后修饰与核转运过程、维持 mRNA 稳定性及调控翻译效率，对 mRNA 的生物学功能至关重要。
2. RNA-seq 关键技术参数
2.1 测序深度（Sequencing depth）
测序深度又称 “乘数”，是指测序过程中样本中每个碱基被检测到的平均次数，是衡量测序数据量的核心参数，通常用 “X” 表示（如 100X 代表平均每个碱基被测序 100 次）。其计算逻辑为测序获得的总有效数据量与目标基因组（或转录组）大小的比值。
Q1：测序深度的单位 “X” 代表什么含义？
A1：“X” 代表样本中每个碱基被测序的平均次数，例如 50X 即表示平均每个碱基在测序中被检测到 50 次。
Q2：计算测序深度时，分子和分母分别对应什么数据？
A2：分子是测序获得的总有效数据量，分母是目标研究对象（如基因组或转录组）的总大小，两者的比值即为测序深度。
2.2 测序覆盖度（Coverage）
测序覆盖度又称 “覆盖率”，是指测序过程中被检测到的碱基数量占目标基因组（或转录组）总碱基数量的比率，通常用百分比（%）表示。例如，对人类基因组（大小约 3G）测序后，若有 2.7G 碱基至少被 1 条读段覆盖，则测序覆盖度为 90%（2.7G/3G×100%）。
Q1：测序覆盖度与测序深度的核心区别是什么？
A1：测序覆盖度反映 “被检测到的碱基范围占比”，用百分比表示；测序深度反映 “每个碱基被检测的平均次数”，用 “X” 表示，两者分别从 “范围” 和 “次数” 描述测序效果。
Q2：若目标基因组大小为 2G，测序后有 1.8G 碱基被覆盖，其测序覆盖度是多少？
A2：测序覆盖度为 90%，计算方式为被覆盖的碱基量（1.8G）除以目标基因组大小（2G），再乘以 100%。
2.3 reads
reads 是 RNA-seq 测序的直接结果，指测序过程中仪器检测到的单条 RNA 序列片段，1 条独立的序列片段即称为 1 条 reads。这些 reads 需后续通过比对软件与参考基因组（或转录组）进行匹配，才能用于基因表达量计算、转录本结构分析等研究。
Q1：reads 在 RNA-seq 研究中的作用是什么？
A1：reads 是 RNA-seq 的原始数据基础，通过与参考基因组或转录组比对，可进一步分析基因表达水平、识别转录本结构及发现新转录本。
Q2：1 条 reads 是否等同于 1 个转录本？
A2：不等同。1 条 reads 是转录本的片段序列，1 个完整的转录本通常需要多条 reads 通过拼接或比对后才能完整呈现。
2.4 adapter（接头序列）
adapter 是 RNA-seq 文库构建过程中添加到 RNA 片段两端的短序列，具有类似引物的功能。其核心作用是协助测序仪器识别并结合 RNA 片段，保障测序反应的顺利启动，测序完成后需通过生物信息学分析去除 adapter 序列，避免其对后续数据解读产生干扰。
Q1：adapter 序列在 RNA-seq 中的核心功能是什么？
A1：核心功能是协助测序仪器识别和结合 RNA 片段，为测序反应的启动提供必要条件，是文库构建和测序过程中的关键辅助序列。
Q2：测序完成后为何需要去除 adapter 序列？
A2：因为 adapter 是人工添加的辅助序列，并非样本自身的 RNA 片段，若不去除会干扰基因表达量计算、转录本比对等后续分析，影响结果准确性。
RNA-seq 核心概念与技术参数对照表
3. 总结
RNA-seq 作为高通量测序技术，通过检测转录组中的 RNA 分子，可实现基因表达水平分析、新转录本发现及转录后修饰研究。理解转录组、转录本等基础概念，掌握测序深度、覆盖度、reads、adapter 等关键技术参数，是开展 RNA-seq 研究及解读数据结果的核心前提，为后续基因功能解析、生物过程调控机制研究提供基础支撑。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| 转录组测序(RNA-seq)实验服务 | LX-RNAseq | / |
| 转录组测序（RNA-seq）检测试剂盒 | LXR-RNAseq | / |
| NEXTFLEX® Small RNA-Seq Kit v3 | NOVA-5132-05 | 8rxns |
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