ChIP-seq等揭示大豆开花时间调控及区域适应性的表观分子机制
2025-10-21 来源:本站 点击次数:40
近日，华南农业大学生命科学学院王应祥课题组和华南农业大学农学院杨存义课题组合作探究了大豆开花进程的调控机制，特别是组蛋白去甲基化酶GmLDL2（Lysine-specific demethylase like 2）在大豆适应低纬度地区中的作用。具体而言，研究者通过筛选早花突变体ef1并鉴定其因果基因GmLDL2，结合ChIP-seq和RNA-seq等分析，揭示了GmLDL2通过直接调控下游靶基因GmFER（拟南芥FERONIA直系同源物）的表达来调控大豆开花进程，进而影响大豆在不同纬度地区的适应性。这一发现为通过分子设计育种改善大豆区域适应性提供了重要的理论基础和潜在靶点。相关研究成果以“Natural variation in histone demethylase GmLDL2 confers flowering time divergence for geographical expansion in soybean”为题发表于《Nature Communications》（自然通讯）。
标题：Natural variation in histone demethylase GmLDL2 confers flowering time divergence for geographical expansion in soybean（组蛋白去甲基化酶GmLDL2自然变异调控大豆开花时间分化和地理适应性）
发表时间：2025年7月1日
发表期刊：Nature Communications
影响因子：IF15.7/Q1
技术平台：ChIP-seq、RNA-seq等（易基因金牌技术）
作者单位：华南农业大学
DOI：10.1038/s41467-025-61328-6
在适当的时间开花是决定大豆区域适应性和产量的关键性状之一。此前，尽管已在大豆中鉴定出几个调控开花时间的关键基因，但相关表观遗传调控因子尚不完全清楚。本研究鉴定出一个早花突变体（ef1），并克隆其“因果”基因GmLDL2。其中，酶活性实验表明，GmLDL2对H3K4me1和H3K4me2（H3K4me1/2）具有去甲基化活性。ChIP-seq和RNA-seq整合分析表明，GmLDL2直接抑制大豆FERONIA同源基因GmFER表达。遗传分析揭示GmLDL2以GmFER依赖性方式调控大豆开花。GmLDL2两种单倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2表现出差异去甲基化活性，可能分别促进大豆对低纬度和高纬度地区适应性。总之，本研究发现揭示了GmLDL2-GmFER模块在调控大豆开花中的作用，并为改良大豆的区域适应性补充了关键信息。
图形摘要：GmLDL2在调控大豆开花时间和提高低纬度适应性中的作用模型
在自然选择下，GmLDL2H1等位基因促进大豆在低纬度地区适应；在人工选择下，GmLDL2H2等位基因促进大豆在高纬度地区适应。GmLDL2通过改变GmFER基因位点上的H3K4甲基化状态抑制GmFER表达，进而调控开花时间。
研究方法
（1）早花大豆突变体ef1筛选与并因果基因鉴定
通过60Co γ射线诱变HX3，筛选获得稳定遗传的早花突变体ef1，ef1在短日照（SD）和长日照（LD）条件下均表现出显著早花。通过图位克隆技术，将ef1基因定位到第6染色体的一个0.5 Mb区域，并最终鉴定出GmLDL2基因。GmLDL2基因编码一个与拟南芥组蛋白去甲基化酶LDL2同源的蛋白，ef1突变体中GmLDL2基因的第一外显子存在1 bp缺失，导致移码突变和提前终止，产生截短蛋白（图1h）。这一结果为后续研究提供了基础。
b. 短日照（SD,11h光照/13h黑暗）和长日照（LD,15h光照/9h黑暗）条件下，HX3和ef1开花时间。
c. 在广州夏季的田间条件下，HX3和ef1的成熟时间。
d. 在田间条件下，全年播种日期与HX3和ef1开花时间的关系。
e. 在田间条件下，HX3与ef1杂交的F2代开花时间频率分布。
f. 沿染色体的SNP指数分布。
g. 广东农家品种LNHM与ef1的F2群体进行ef1的精细定位。
h. AtLDL2和GmLDL2的比较。粉色和灰色方块分别代表SWRIM和胺氧化酶结构域。
（2）验证GmLDL2在调控大豆开花中的功能
为了验证GmLDL2的功能，研究者将GmLDL2基因的编码序列（CDS）在ef1突变体背景下过表达。转基因植株开花时间延迟，证实了GmLDL2是ef1突变体早期开花的因果基因。此外，利用CRISPR/Cas9技术在HX3背景中敲除GmLDL2基因，生成了两个Gmldl2突变体Gmldl2-2和Gmldl2-3，它们均表现出早花表型，进一步验证GmLDL2的功能。这些结果表明GmLDL2在大豆开花调控中起着关键作用。
b. 在短日照和长日照条件下，HX3、ef1和两个GmLDL2过表达转基因系的开花时间。
c. 敲除GmLDL2的CRISPR/Cas9的sgRNA设计。
d. HX3和Gmldl2突变体中GmLDL2的预测氨基酸序列。
e. 在短日照条件下，HX3、ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3的植株和花朵的表型。与HX3相比，ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3开花更早。
f. 在短日照和长日照条件下，所有受检品种的开花时间。
g-h. 在短日照条件下，HX3、ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3在ZT4时GmFT2a和GmFT5a的表达水平。
（3）GmLDL2的组蛋白去甲基化酶活性测定
通过体外实验，研究者发现GmLDL2对H3K4me1和H3K4me2具有去甲基化活性，但对H3K4me3、H3K9me2、H3K27me1或H3K36me3没有活性。在烟草叶片中瞬时表达GmLDL2，并检测其对组蛋白修饰的影响，发现GmLDL2显著降低了H3K4me1和H3K4me2的信号水平。这些结果表明GmLDL2是一个特异性H3K4去甲基化酶，可能通过调控H3K4me1和H3K4me2水平来作用基因表达。
b. 使用ImageJ对（a）进行定量分析。
c. GmLDL2-GFP在本氏烟（N.benthamiana）叶片中显示出H3K4me1/2去甲基化活性。
d. 对（c）中的荧光信号水平进行统计分析。
（4）GmLDL2介导基因表达的转录组分析
对HX3和ef1的叶片进行RNA-seq分析，发现与HX3相比，ef1中有440个基因上调和372个基因下调。GO富集分析发现上调基因主要参与激酶活性、转移酶活性、DNA结合转录因子活性和转录调控活性，而下调基因主要富集在分子功能、结合、细胞外区域和细胞壁功能。KEGG分析显示，上调基因与脂肪酸代谢、亚油酸代谢、单萜生物合成等通路相关，而下调基因主要富集在异喹啉生物碱代谢、柠檬烯和蒎烯降解等通路。这些结果表明GmLDL2可能通过调控这些基因的表达来影响大豆的开花时间和适应性。
b-c. 分别在ef1中上调的440个基因或下调的372个基因中富集的GO分析。外圈表示GO分类，中圈表示大豆基因组背景中每个GO基因数量，内圈表示差异表达基因的数量。
d. HX3和ef1中已知开花调控基因的表达谱热图。
（5）GmLDL2结合位点的ChIP-seq分析
利用ChIP-seq技术，研究者鉴定出GmLDL2在全基因组范围内的结合位点。通过抗GmLDL2抗体进行ChIP-seq分析，发现GmLDL2结合位点主要分布在基因区域，尤其是基因下游区域。分析H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3的分布模式，发现它们在基因区域的分布模式不同，H3K4me1和H3K4me2在基因下游区域的水平较高。这些结果表明GmLDL2可能通过结合特定基因区域并调控H3K4me1和H3K4me2的水平来影响基因表达。ChIP-seq分析还揭示了GmLDL2结合位点与基因表达水平之间的相关性，为后续研究提供了重要的线索。
b. 在HX3和ef1中，根据表达水平分为三组基因的H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3的reads分布。将genebody区域划分为等分区间，以10 bp滑动窗口计算TSS上游1.5 kb和TES下游reads分布。Metaplots表示每组基因的归一化reads分布平均值。热图显示所有基因的reads分布。每组基因按基因表达水平（FPKM）从高到低排序。TSS表示转录起始位点，TES表示转录终止位点。
c. 在ef1中上调基因、ef1中H3K4me1/2高甲基化基因以及GmLDL2结合基因间的重叠维恩图。
d. HX3和ef1中GmFER位点的RNA-seq、抗GmLDL2、抗H3K4me1和抗H3K4me2 ChIP-seq数据的基因组轨迹。
e. GmFER表达水平的qRT-PCR分析。
f-g. GmFER位点的H3K4me1和H3K4me2甲基化状态的ChIP-qPCR分析。
h. GmLDL2与GmFER位点结合的ChIP-qPCR分析。
（6）鉴定GmLDL2的特定靶基因
结合RNA-seq和ChIP-seq数据，研究者鉴定出GmLDL2的特定靶基因GmFER。GmFER基因与拟南芥FERONIA基因同源，其在ef1中的表达显著上调，并且GmLDL2结合位点的H3K4me1和H3K4me2水平增加。通过RT-qPCR和ChIP-qPCR验证GmFER在ef1中表达上调，且GmLDL2结合位点的H3K4me1和H3K4me2水平增加。这些结果表明GmLDL2通过直接结合GmFER基因并调控其H3K4me1和H3K4me2水平来抑制其表达，进而调控大豆的开花时间。
（7）GmLDL2通过GmFER依赖性方式负向调控大豆开花
在拟南芥中过表达GmFER，发现开花时间提前，表明GmFER在开花调控中发挥促进作用。在大豆中过表达GmFER，同样发现开花时间提前。通过CRISPR/Cas9技术在Gmldl2突变体背景下敲除GmFER，生成Gmldl2/fer双突变体，发现双突变体开花时间延迟。这些结果表明GmLDL2通过GmFER依赖性方式负向调控大豆开花，揭示了GmLDL2-GmFER模块在大豆开花时间调控中的重要作用。
b. HX3和GmFER-OE转基因植株中GmFER的表达水平。。
c. 使用抗Flag抗体的western blot验证GmFER-OE转基因植株中GmFER的表达。
d. 在短日照和长日照条件下，HX3和GmFER-OE植株的开花时间。
e. 在Gmldl2突变体背景下，敲除GmFER的CRISPR/Cas9的sgRNA设计。
f. HX3和Gmldl2/fer双突变体中GmLDL2和GmFER的预测氨基酸序列。
g. 在长日照条件下，HX3、ef1、Gmldl2-2/fer和Gmldl2-3/fer的植株和花朵表型。与ef1相比，所有Gmldl2/fer双突变体开花更晚。
h. 在短日照和长日照条件下，所有受检品种的开花时间。
（8）不同的GmLDL2等位基因促进大豆区域适应性
通过对2898份大豆品种的全基因组重测序数据分析，发现GmLDL2基因存在两种主要单倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2。GmLDL2H1在低纬度地区的大豆品种中频率较高，而GmLDL2H2在高纬度地区的大豆品种中频率较高。这两种单倍型的GmLDL2在H3K4me2的去甲基化活性上存在显著差异，GmLDL2H1的活性高于GmLDL2H2（图7d-g）。这些结果表明GmLDL2的不同等位基因可能通过调控GmFER表达水平来影响大豆的开花时间和区域适应性。
b. 在三个种质群体中，GmLDL2单倍型比例。
c. 在中国，携带GmLDL2H1和GmLDL2H2栽培品种的地理分布。NE表示中国东北地区；NR表示中国北部地区；HR表示中国黄淮地区；SR表示中国南方地区。
d. 在本氏烟叶片中对GmLDL2H1和GmLDL2H2的去甲基化活性进行测定。
e. 对(d)中的荧光信号强度进行的统计分析。
f. H3K4me1/2去甲基化活性测定，使用特异性甲基化抗体确定组蛋白的甲基化状态。
g. 使用ImageJ对(f)进行的定量分析。
h–j. 在广州和三亚的自然短日照条件下，携带GmLDL2H1（n=18个品种）和GmLDL2H2（n=46个品种）的大豆品种的开花时间、株高和粒重统计情况。
结论和启示
本研究揭示了GmLDL2在大豆开花进程调控中的重要作用，特别是其通过直接调控GmFER基因表达来影响大豆的开花时间和区域适应性。GmLDL2作为一个特异性H3K4去甲基化酶，通过结合GmFER基因并调控其H3K4me1和H3K4me2水平来抑制其表达。这一调控机制独立于经典的EC-E1通路，为理解大豆开花进程调控提供了新的视角。此外，GmLDL2的不同等位基因在大豆适应低纬度和高纬度地区中分别发挥作用，表明GmLDL2在大豆驯化和适应性进化中具有重要意义。
ChIP-seq和RNA-seq技术在本研究中发挥了关键作用，不仅帮助鉴定GmLDL2的结合位点和靶基因，还揭示了GmLDL2调控基因表达的分子机制。这些技术的应用为未来类似研究提供了宝贵的经验和参考。
参考文献：
Liu M, Fang Y, Jiang J, Chen H, Yang B, Xu X, Liu G, Ling C, Dong Z, Yang C, Wang Y. Natural variation in histone demethylase GmLDL2 confers flowering time divergence for geographical expansion in soybean. Nat Commun. 2025 Jul 1;16(1):5687. doi: 10.1038/s41467-025-61328-6.
标题：Natural variation in histone demethylase GmLDL2 confers flowering time divergence for geographical expansion in soybean（组蛋白去甲基化酶GmLDL2自然变异调控大豆开花时间分化和地理适应性）
发表时间：2025年7月1日
发表期刊：Nature Communications
影响因子：IF15.7/Q1
技术平台：ChIP-seq、RNA-seq等（易基因金牌技术）
作者单位：华南农业大学
DOI：10.1038/s41467-025-61328-6
在适当的时间开花是决定大豆区域适应性和产量的关键性状之一。此前，尽管已在大豆中鉴定出几个调控开花时间的关键基因，但相关表观遗传调控因子尚不完全清楚。本研究鉴定出一个早花突变体（ef1），并克隆其“因果”基因GmLDL2。其中，酶活性实验表明，GmLDL2对H3K4me1和H3K4me2（H3K4me1/2）具有去甲基化活性。ChIP-seq和RNA-seq整合分析表明，GmLDL2直接抑制大豆FERONIA同源基因GmFER表达。遗传分析揭示GmLDL2以GmFER依赖性方式调控大豆开花。GmLDL2两种单倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2表现出差异去甲基化活性，可能分别促进大豆对低纬度和高纬度地区适应性。总之，本研究发现揭示了GmLDL2-GmFER模块在调控大豆开花中的作用，并为改良大豆的区域适应性补充了关键信息。
图形摘要：GmLDL2在调控大豆开花时间和提高低纬度适应性中的作用模型
研究方法
- 早花突变体ef1筛选和基因鉴定：诱变大豆品种Huaxia3（HX3），筛选出早期开花突变体ef1。克隆鉴定出GmLDL2基因，该基因编码拟南芥组蛋白去甲基化酶LDL2同源蛋白。
- GmLDL2功能验证：在ef1突变体背景下过表达GmLDL2基因，发现转基因植株开花时间延迟，证实GmLDL2是ef1突变体早花的因果基因。敲除GmLDL2基因进一步验证GmLDL2功能。
- GmLDL2组蛋白去甲基化酶活性测定：体外实验发现GmLDL2对H3K4me1/2具有去甲基化活性。在烟草叶片中瞬时表达GmLDL2，并检测其对组蛋白修饰的作用，进一步验证其去甲基化酶活性。
- 转录组分析（RNA-seq）：对HX3（对照组）和ef1（突变组）叶片进行RNA-seq分析，发现ef1中有440个基因上调和372个基因下调。GO和KEGG分析揭示这些差异表达基因的功能富集。
- ChIP-seq：利用ChIP-seq技术鉴定GmLDL2在全基因组范围内的结合位点，并分析其对组蛋白修饰的作用。发现GmLDL2结合并调控的基因GmFER，该基因与拟南芥FERONIA基因同源。
- GmLDL2特定靶基因鉴定：结合RNA-seq和ChIP-seq数据，鉴定GmLDL2的特定靶基因GmFER。RT-qPCR和ChIP-qPCR验证GmFER在ef1中表达上调，且GmLDL2结合位点的H3K4me1/2水平增加。
- GmLDL2在开花时间调控中的功能验证：在拟南芥和大豆中过表达GmFER，发现开花时间提前。在Gmldl2突变体背景下敲除GmFER，生成Gmldl2/fer双突变体，发现双突变体开花时间延迟，进一步验证GmLDL2通过GmFER调控开花时间。
- GmLDL2等位基因的地理适应性分析：通过对2898份大豆品种的全基因组重测序数据分析，发现GmLDL2基因存在两种主要单倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2，其在大豆适应低纬度和高纬度地区中分别发挥作用。
（1）早花大豆突变体ef1筛选与并因果基因鉴定
通过60Co γ射线诱变HX3，筛选获得稳定遗传的早花突变体ef1，ef1在短日照（SD）和长日照（LD）条件下均表现出显著早花。通过图位克隆技术，将ef1基因定位到第6染色体的一个0.5 Mb区域，并最终鉴定出GmLDL2基因。GmLDL2基因编码一个与拟南芥组蛋白去甲基化酶LDL2同源的蛋白，ef1突变体中GmLDL2基因的第一外显子存在1 bp缺失，导致移码突变和提前终止，产生截短蛋白（图1h）。这一结果为后续研究提供了基础。
图1：通过图位克隆鉴定ef1基因。
a. 短日照条件下，HX3和ef1植株及花朵表型。ef1比HX3更早花。b. 短日照（SD,11h光照/13h黑暗）和长日照（LD,15h光照/9h黑暗）条件下，HX3和ef1开花时间。
c. 在广州夏季的田间条件下，HX3和ef1的成熟时间。
d. 在田间条件下，全年播种日期与HX3和ef1开花时间的关系。
e. 在田间条件下，HX3与ef1杂交的F2代开花时间频率分布。
f. 沿染色体的SNP指数分布。
g. 广东农家品种LNHM与ef1的F2群体进行ef1的精细定位。
h. AtLDL2和GmLDL2的比较。粉色和灰色方块分别代表SWRIM和胺氧化酶结构域。
（2）验证GmLDL2在调控大豆开花中的功能
为了验证GmLDL2的功能，研究者将GmLDL2基因的编码序列（CDS）在ef1突变体背景下过表达。转基因植株开花时间延迟，证实了GmLDL2是ef1突变体早期开花的因果基因。此外，利用CRISPR/Cas9技术在HX3背景中敲除GmLDL2基因，生成了两个Gmldl2突变体Gmldl2-2和Gmldl2-3，它们均表现出早花表型，进一步验证GmLDL2的功能。这些结果表明GmLDL2在大豆开花调控中起着关键作用。
图2：GmLDL2延迟大豆的开花时间。
a. 在短日照条件下，HX3、ef1和两个GmLDL2过表达转基因系的植株和花朵的表型。与ef1相比，两个GmLDL2互补系开花更晚。b. 在短日照和长日照条件下，HX3、ef1和两个GmLDL2过表达转基因系的开花时间。
c. 敲除GmLDL2的CRISPR/Cas9的sgRNA设计。
d. HX3和Gmldl2突变体中GmLDL2的预测氨基酸序列。
e. 在短日照条件下，HX3、ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3的植株和花朵的表型。与HX3相比，ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3开花更早。
f. 在短日照和长日照条件下，所有受检品种的开花时间。
g-h. 在短日照条件下，HX3、ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3在ZT4时GmFT2a和GmFT5a的表达水平。
（3）GmLDL2的组蛋白去甲基化酶活性测定
通过体外实验，研究者发现GmLDL2对H3K4me1和H3K4me2具有去甲基化活性，但对H3K4me3、H3K9me2、H3K27me1或H3K36me3没有活性。在烟草叶片中瞬时表达GmLDL2，并检测其对组蛋白修饰的影响，发现GmLDL2显著降低了H3K4me1和H3K4me2的信号水平。这些结果表明GmLDL2是一个特异性H3K4去甲基化酶，可能通过调控H3K4me1和H3K4me2水平来作用基因表达。
图3：GmLDL2是一种H3K4去甲基化酶。
a. 从大肠杆菌中纯化的重组His-GmLDL2与小牛胸腺组蛋白一起孵育，用于H3K4me1/2去甲基化活性测定，使用特异性甲基化抗体确定组蛋白的甲基化状态。b. 使用ImageJ对（a）进行定量分析。
c. GmLDL2-GFP在本氏烟（N.benthamiana）叶片中显示出H3K4me1/2去甲基化活性。
d. 对（c）中的荧光信号水平进行统计分析。
（4）GmLDL2介导基因表达的转录组分析
对HX3和ef1的叶片进行RNA-seq分析，发现与HX3相比，ef1中有440个基因上调和372个基因下调。GO富集分析发现上调基因主要参与激酶活性、转移酶活性、DNA结合转录因子活性和转录调控活性，而下调基因主要富集在分子功能、结合、细胞外区域和细胞壁功能。KEGG分析显示，上调基因与脂肪酸代谢、亚油酸代谢、单萜生物合成等通路相关，而下调基因主要富集在异喹啉生物碱代谢、柠檬烯和蒎烯降解等通路。这些结果表明GmLDL2可能通过调控这些基因的表达来影响大豆的开花时间和适应性。
图4：HX3和ef1的转录组分析。
a. HX3和ef1中差异表达基因的火山图。ef1中上调和下调的基因分别用红色和蓝色突出显示。b-c. 分别在ef1中上调的440个基因或下调的372个基因中富集的GO分析。外圈表示GO分类，中圈表示大豆基因组背景中每个GO基因数量，内圈表示差异表达基因的数量。
d. HX3和ef1中已知开花调控基因的表达谱热图。
（5）GmLDL2结合位点的ChIP-seq分析
利用ChIP-seq技术，研究者鉴定出GmLDL2在全基因组范围内的结合位点。通过抗GmLDL2抗体进行ChIP-seq分析，发现GmLDL2结合位点主要分布在基因区域，尤其是基因下游区域。分析H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3的分布模式，发现它们在基因区域的分布模式不同，H3K4me1和H3K4me2在基因下游区域的水平较高。这些结果表明GmLDL2可能通过结合特定基因区域并调控H3K4me1和H3K4me2的水平来影响基因表达。ChIP-seq分析还揭示了GmLDL2结合位点与基因表达水平之间的相关性，为后续研究提供了重要的线索。
图5：GmLDL2通过H3K4甲基化调控靶基因GmFER转录。
a. 在genebody区域以及±1.5 kb处的H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3信号的归一化reads分布，线条显示HX3和ef1中所有基因的平均值。b. 在HX3和ef1中，根据表达水平分为三组基因的H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3的reads分布。将genebody区域划分为等分区间，以10 bp滑动窗口计算TSS上游1.5 kb和TES下游reads分布。Metaplots表示每组基因的归一化reads分布平均值。热图显示所有基因的reads分布。每组基因按基因表达水平（FPKM）从高到低排序。TSS表示转录起始位点，TES表示转录终止位点。
c. 在ef1中上调基因、ef1中H3K4me1/2高甲基化基因以及GmLDL2结合基因间的重叠维恩图。
d. HX3和ef1中GmFER位点的RNA-seq、抗GmLDL2、抗H3K4me1和抗H3K4me2 ChIP-seq数据的基因组轨迹。
e. GmFER表达水平的qRT-PCR分析。
f-g. GmFER位点的H3K4me1和H3K4me2甲基化状态的ChIP-qPCR分析。
h. GmLDL2与GmFER位点结合的ChIP-qPCR分析。
（6）鉴定GmLDL2的特定靶基因
结合RNA-seq和ChIP-seq数据，研究者鉴定出GmLDL2的特定靶基因GmFER。GmFER基因与拟南芥FERONIA基因同源，其在ef1中的表达显著上调，并且GmLDL2结合位点的H3K4me1和H3K4me2水平增加。通过RT-qPCR和ChIP-qPCR验证GmFER在ef1中表达上调，且GmLDL2结合位点的H3K4me1和H3K4me2水平增加。这些结果表明GmLDL2通过直接结合GmFER基因并调控其H3K4me1和H3K4me2水平来抑制其表达，进而调控大豆的开花时间。
（7）GmLDL2通过GmFER依赖性方式负向调控大豆开花
在拟南芥中过表达GmFER，发现开花时间提前，表明GmFER在开花调控中发挥促进作用。在大豆中过表达GmFER，同样发现开花时间提前。通过CRISPR/Cas9技术在Gmldl2突变体背景下敲除GmFER，生成Gmldl2/fer双突变体，发现双突变体开花时间延迟。这些结果表明GmLDL2通过GmFER依赖性方式负向调控大豆开花，揭示了GmLDL2-GmFER模块在大豆开花时间调控中的重要作用。
图6：GmLDL2以GmFER依赖性方式调控开花。
a. 在短日照条件下，HX3和两个GmFER过表达（GmFER-OE）转基因系的植株和花朵表型。与HX3相比，两个独立的GmFER-OE转基因植株开花更早。b. HX3和GmFER-OE转基因植株中GmFER的表达水平。。
c. 使用抗Flag抗体的western blot验证GmFER-OE转基因植株中GmFER的表达。
d. 在短日照和长日照条件下，HX3和GmFER-OE植株的开花时间。
e. 在Gmldl2突变体背景下，敲除GmFER的CRISPR/Cas9的sgRNA设计。
f. HX3和Gmldl2/fer双突变体中GmLDL2和GmFER的预测氨基酸序列。
g. 在长日照条件下，HX3、ef1、Gmldl2-2/fer和Gmldl2-3/fer的植株和花朵表型。与ef1相比，所有Gmldl2/fer双突变体开花更晚。
h. 在短日照和长日照条件下，所有受检品种的开花时间。
（8）不同的GmLDL2等位基因促进大豆区域适应性
通过对2898份大豆品种的全基因组重测序数据分析，发现GmLDL2基因存在两种主要单倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2。GmLDL2H1在低纬度地区的大豆品种中频率较高，而GmLDL2H2在高纬度地区的大豆品种中频率较高。这两种单倍型的GmLDL2在H3K4me2的去甲基化活性上存在显著差异，GmLDL2H1的活性高于GmLDL2H2（图7d-g）。这些结果表明GmLDL2的不同等位基因可能通过调控GmFER表达水平来影响大豆的开花时间和区域适应性。
图7：GmLDL2对大豆纬度适应性的贡献
a. 在野生大豆、地方品种和改良品种中，GmLDL2的2Mb基因组区域内，Fst指示的核苷酸变异情况。b. 在三个种质群体中，GmLDL2单倍型比例。
c. 在中国，携带GmLDL2H1和GmLDL2H2栽培品种的地理分布。NE表示中国东北地区；NR表示中国北部地区；HR表示中国黄淮地区；SR表示中国南方地区。
d. 在本氏烟叶片中对GmLDL2H1和GmLDL2H2的去甲基化活性进行测定。
e. 对(d)中的荧光信号强度进行的统计分析。
f. H3K4me1/2去甲基化活性测定，使用特异性甲基化抗体确定组蛋白的甲基化状态。
g. 使用ImageJ对(f)进行的定量分析。
h–j. 在广州和三亚的自然短日照条件下，携带GmLDL2H1（n=18个品种）和GmLDL2H2（n=46个品种）的大豆品种的开花时间、株高和粒重统计情况。
结论和启示
本研究揭示了GmLDL2在大豆开花进程调控中的重要作用，特别是其通过直接调控GmFER基因表达来影响大豆的开花时间和区域适应性。GmLDL2作为一个特异性H3K4去甲基化酶，通过结合GmFER基因并调控其H3K4me1和H3K4me2水平来抑制其表达。这一调控机制独立于经典的EC-E1通路，为理解大豆开花进程调控提供了新的视角。此外，GmLDL2的不同等位基因在大豆适应低纬度和高纬度地区中分别发挥作用，表明GmLDL2在大豆驯化和适应性进化中具有重要意义。
ChIP-seq和RNA-seq技术在本研究中发挥了关键作用，不仅帮助鉴定GmLDL2的结合位点和靶基因，还揭示了GmLDL2调控基因表达的分子机制。这些技术的应用为未来类似研究提供了宝贵的经验和参考。
参考文献：
Liu M, Fang Y, Jiang J, Chen H, Yang B, Xu X, Liu G, Ling C, Dong Z, Yang C, Wang Y. Natural variation in histone demethylase GmLDL2 confers flowering time divergence for geographical expansion in soybean. Nat Commun. 2025 Jul 1;16(1):5687. doi: 10.1038/s41467-025-61328-6.
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