期刊：Cell reports. Medicine
影响因子：10.6
主要技术：scRNA-seq、Stereo-seq

导语
原发性移植物功能障碍（PGD）是肺移植后早期发病率和死亡率的主要原因，中性粒细胞在其炎症病理中起着核心作用。文章利用scRNA-seq和Stereo-seq等技术，研究肺缺血再灌注损伤（IRI）模型中的中性粒细胞亚型。研究发现CD177+中性粒细胞是一个活化的亚群，显著促进了肺损伤，并作为预测人类肺移植受者中重度PGD的早期生物标志物。CD177+中性粒细胞表现出增强的氧化磷酸化和增加的线粒体复合体I活性，推动炎症反应和中性粒细胞外陷阱的形成。通过使用复合体I抑制剂IACS-010759靶向线粒体功能，可以减少CD177+中性粒细胞的活化，并在小鼠IRI模型和大鼠左肺移植模型中减轻肺损伤。这些发现为CD177+中性粒细胞驱动的肺IRI炎症提供了全面的图景，并强调了其在未来早期诊断和治疗干预中的潜在价值。

主要技术
scRNA-seq、Stereo-seq

研究结果
1. IRI小鼠肺组织的免疫学特征为显著的Cd177+中性粒细胞浸润
对10个左肺组织（6个IRI与4个假手术）进行scRNA-seq测序，保留了43,852个免疫细胞转录组用于后续分析（图1B）。进行聚类和注释得到CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞、B细胞和髓系细胞，发现髓系细胞中差异表达基因（DEGs）的数量大大超过了其他免疫细胞群体中的数量，表明在肺IRI期间存在强大的先天免疫激活（图1C）。对比IRI组和假手术对照组的髓系细胞，发现参与急性白细胞反应的巨噬细胞和单核细胞高表达Stat3、S100a8、S100a9等，并在IRI组中迁移至受损肺部（图1D）。进一步研究发现，中性粒细胞是在再灌注后最被激活的细胞类型（图1E）。因此，将分析重点放在小鼠scRNA-seq数据中被鉴定为肺相关中性粒细胞（LAN）的2973个细胞上（图1F）。所有LAN细胞的基因表达模式划分出5种转录上不同的状态（图1G-H）。其中，LAN3在IRI组中显著增加（图1I），差异表达基因（DEGs）和GO富集分析显示LAN3参与超氧阴离子生成和细胞杀伤（图1J）。另外，LAN3显示出最高的颗粒评分,特异性表达与炎症相关的基因Cd177。综上所述，这些发现表明CD177可能参与了肺IRI期间中性粒细胞的激活过程。

图 1

2. Cd177+中性粒细胞的激活是缺血再灌注诱导的肺损伤的主要原因
为阐明Cd177+中性粒细胞的作用，采用Stereo-seq技术来验证scRNA-seq。利用分水岭算法对核酸染色图像进行单细胞分割，得到了细胞的空间分布（图2A）。接着，在免疫细胞浸润区域发现Cd177转录本水平升高，并且特定颗粒基因（Ltf）和模式识别蛋白（Pglyrp1）的表达也有所增加（图2B-C）。进一步分析了Cd177+和Cd177−中性粒细胞，与scRNA-seq中的LAN3一致，Cd177+中性粒细胞与急性反应以及白细胞介素1和肿瘤坏死因子α产生相关的转录本富集，并且在受损的IRI肺部区域，瓜氨酸化组蛋白H3（Cit-H3）、CD177和Ly6G共定位，表明Cd177+中性粒细胞是一个功能上被激活的群体（图2D-E）。为了系统地研究CD177+中性粒细胞的影响，研究人员生成了Cd177flox/flox；Ly6gCre小鼠，这种小鼠的中性粒细胞中特异性地缺失了Cd177基因。体外实验显示，人类和小鼠的CD177缺失中性粒细胞均表现出活性氧（ROS）产生的减少，并且在形成中性粒细胞外陷阱（NET）方面效率较低，表现为双链DNA（dsDNA）产生量减少（图2F-G）。在肺门阻断肺IRI模型中，Cd177flox/flox；Ly6gCre小鼠的左肺显示出最小的损伤，保持了结构完整性，且缺乏肺泡水肿或透明膜形成，NETs的浸润几乎不存在（图2H-I）。这些结果表明，Cd177+中性粒细胞在肺IRI发病机制中起重要作用，而Cd177基因缺失可以有效减轻肺损伤并保留功能。

图 2

3. 外周血CD177+细胞作为重度PGD的早期预测因子
为探究IRI小鼠肺部Cd177+中性粒细胞的来源，对来自血液的存活中性粒细胞（IRI组与假手术组，各3份）进行了scRNA-seq测序。得到PBN1-4四个亚群，其中PBN3在IRI组显著富集，表现为低表达成熟标记物Cxcr4、Sell、高表达Mmp8、Sa1008、Camp等的Cd177+中性粒细胞，与LAN3群体一致（图3A-C）。通过骨髓亲和性评分、CytoTrace和Monocle3分析，发现PBN3和LAN3处于最少分化的状态，表明Cd177+中性粒细胞是一种未成熟的激活细胞，可能在IRI期间从骨髓迅速释放并被招募至肺部（图3D-F）。

此外，研究人员评估了104名肺移植受者（LTRs）在移植前和移植后4小时的血液样本，其中25人在移植后72小时内发展为3级PGD。通过流式细胞术分析外周血中的CD177+中性粒细胞，发现移植后4小时内CD177+中性粒细胞比例的变化（ΔCD177+中性粒细胞）可作为3级PGD的早期诊断指标。与传统的中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）相比，ΔCD177+中性粒细胞在3级PGD组中显著更高（图3G-H），且具有更高的预测能力，逻辑回归分析显示其比值比为1.813，特征曲线分析也表明其具有出色的预测能力（AUC = 0.871）（图3I）。

图 3

4. CD177+中性粒细胞表现出增加的复合体I形成和线粒体活性
研究人员利用单细胞代谢组学技术(scMetabolism）评估小鼠中性粒细胞的代谢途径活性，发现LAN3群体在氧化磷酸化（OXPHOS）和碳水化合物代谢方面显著富集，表明线粒体OXPHOS是Cd177+中性粒细胞激活的基础（图4A-B）。蛋白质组学分析显示，人类和小鼠的CD177+中性粒细胞中多种蛋白质表达升高，特别是与OXPHOS相关的通路（图4C-D）。人类CD177+细胞中线粒体复合体I的核心亚基NDUFA11和NDUFS1水平显著增加（图4E）。透射电子显微镜和荧光染色揭示，CD177−细胞的线粒体嵴腔更窄，活性氧减少，而CD177+细胞的氧气消耗率（OCR）更高（图4F-4G）。PAGE和免疫印迹分析进一步证实了CD177+细胞中NDUFS1表达的显著增加（图4H）。共聚焦显微镜观察到，CD177与整合素αMβ2（MAC-1和CD11b/CD18）相互作用可增加线粒体活性氧（图4I）。分析CD11b相互作用组发现，ILK（整合素连接激酶）是关键因素，可能通过激活AKT/mTOR信号通路调节线粒体复合体I基因转录。共聚焦显微镜和共免疫沉淀实验显示，CD177+细胞中CD11b与ILK的相互作用更强（图4-K），且ILK与AKT存在显著相互作用并伴随AKT和mTOR的磷酸化（图4L）。使用ILK、AKT和mTOR的抑制剂和激动剂进行实验，结果表明ILK-AKT-mTOR轴是驱动CD177+细胞中线粒体复合体I激活的关键途径。抑制这些信号分子可降低CD177+细胞中NDUFS1的表达和OXPHOS活性，而激活则产生相反效果（图4G-L）。这些结果揭示了CD177/MAC-1复合体通过ILK激活AKT/mTOR信号通路，促进CD177+中性粒细胞中的OXPHOS。

图 4

5. 高效和选择性复合物I抑制剂IACS- 010759减轻小鼠IRI症状
研究人员评估了线粒体复合体I抑制剂IACS对CD177+中性粒细胞的抗炎效果。结果显示， 20和50 nmol/L 的IACS显著降低了人类CD177+中性粒细胞的氧气消耗率（OCR）（图5A），并且降低了ROS、NET形成以及CAMP和LTF的表达。为评估靶向OXPHOS是否能有效减轻肺IRI，C57BL/6小鼠在手术前3小时通过静脉注射接受了1 mg/kg 的IACS，结果表明，IACS处理显著减轻了肺损伤评分（图5B）。为确认系统性IACS给药会影响体内中性粒细胞的线粒体功能，研究人员对IACS处理和未处理IRI肺的中性粒细胞进行了scRNA-seq测序。经过质量控制和数据整合后，研究人员获得了11,150个Cd177+细胞（IACS组：2,363个，对照组：8,787个；图5C）。IACS处理组中Cd177+细胞的比例显著降低（图5D），且OXPHOS、ETC和脱颗粒相关基因评分均有所降低（图5E）。表明IACS可以在体内外抑制Cd177+中性粒细胞的激活。此外，研究人员采用原位左肺移植大鼠模型来模拟长时间冷缺血再灌注损伤。左供肺在4℃下保存18小时后移植，再灌注2小时后取出移植肺（图5F）。接受IACS治疗的受体大鼠显示出损伤减轻和肺泡结构得以保留（图5G），且浸润性中性粒细胞和NETs更少（图5H）。IACS还保护肺部免受再灌注后肺水肿的影响，改善肺顺应性，降低阻力，并增强氧合（图5I）。这些结果表明，通过抑制线粒体复合体I来靶向氧化磷酸化是一种缓解肺缺血再灌注损伤的可行治疗策略。

图 5

结语
本研究聚焦于CD177+中性粒细胞在肺缺血再灌注损伤（IRI）中的作用。发现其炎症基因表达增加和NETs形成与IRI密切相关。CD177/MAC-1复合体通过激活AKT/mTOR轴，增加线粒体复合体I表达，促进OXPHOS。使用复合体I抑制剂IACS在小鼠和大鼠模型中减轻了肺损伤。此外，移植后4小时受者血液中的CD177+中性粒细胞可作为3级PGD的潜在生物标志物。研究还揭示了CD177+中性粒细胞在多种无菌性炎症状态下的扩增现象。尽管CD177+中性粒细胞的扩增与多种疾病的发生和严重程度相关，但其作为治疗靶点的潜力尚未被充分挖掘。研究结果表明，靶向OXPHOS可能是一种有效的治疗策略，但需要进一步研究以减少潜在的不良影响。

参考文献：
Wu J, Gao P, Yang C, et al.Targeting mitochondrial complex I of CD177+ neutrophils alleviates lung ischemia-reperfusion injury. Cell Rep Med. 2025 May 20;6(5):102140. doi: 10.1016/j.xcrm.2025.102140 . PMID: 40398393; PMCID: PMC12147905.