DAP-seq助力揭示PagHSF4调控杨树生长发育与耐盐性的分子机制
2025-10-29 来源:本站 点击次数:492025年7月29日，山西农业大学王升级团队在Industrial Crops & Products期刊发表了一篇题为“PagHSF4 mediates the biosynthesis of jasmonic acid and plant hormone signal transduction to regulate the growth and development as well as salt stress tolerance of poplar”研究论文。该研究借助DAP-seq技术，鉴定出PagHSF4多个关键下游靶基因，为深入解析PagHSF4调控杨树生长发育与盐胁迫响应的分子机制提供了关键实验依据，填补了木本植物B类热休克因子（HSF）功能研究的部分空白。蓝景科信为该研究提供了DAP-seq技术支持。
文章主要内容
研究背景
植物作为固着生物，需通过复杂基因调控网络（含转录因子、激素信号等）适应环境并调控生长，其中热休克因子（HSFs）是关键转录因子，根据结构差异可分为A、B、C三类。目前研究多聚焦于功能广泛的A类HSFs，而B类HSFs因被认为主要参与胁迫响应，其在植物生长发育中的作用长期被忽视。杨树作为重要的工业用材林树种，具有生长快、适应性强等特点，但盐胁迫等环境因素严重制约其生长与产量。此前研究发现，杨树HSF家族中部分成员参与逆境响应，却鲜有研究揭示B类HSFs如何协同调控生长发育与胁迫耐受。
研究结果
前期研究发现杨树HSF4（HSFB1）具组织特异性表达，受多激素诱导且在盐胁迫下被诱导。本研究从84K杨中克隆该基因并命名为PagHSF4。盐胁迫表型分析显示，PagHSF4在杨树叶、根中持续上调，分别于12h、24h达峰值；亚细胞定位证实其定位于细胞核；酵母转录激活实验显示其无转录激活能力，同时其C端存在抑制基序，表明其可能为转录抑制因子。
植物作为固着生物，需通过复杂基因调控网络（含转录因子、激素信号等）适应环境并调控生长，其中热休克因子（HSFs）是关键转录因子，根据结构差异可分为A、B、C三类。目前研究多聚焦于功能广泛的A类HSFs，而B类HSFs因被认为主要参与胁迫响应，其在植物生长发育中的作用长期被忽视。杨树作为重要的工业用材林树种，具有生长快、适应性强等特点，但盐胁迫等环境因素严重制约其生长与产量。此前研究发现，杨树HSF家族中部分成员参与逆境响应，却鲜有研究揭示B类HSFs如何协同调控生长发育与胁迫耐受。
研究结果
前期研究发现杨树HSF4（HSFB1）具组织特异性表达，受多激素诱导且在盐胁迫下被诱导。本研究从84K杨中克隆该基因并命名为PagHSF4。盐胁迫表型分析显示，PagHSF4在杨树叶、根中持续上调，分别于12h、24h达峰值；亚细胞定位证实其定位于细胞核；酵母转录激活实验显示其无转录激活能力，同时其C端存在抑制基序，表明其可能为转录抑制因子。
图1. PagHSF4基因在盐胁迫下的表达模式及编码蛋白的特征
为了探究PagHSF4功能，作者构建了杨树PagHSF4过表达（OE）和抑制表达（RS）转基因株系，选取其中PagHSF4表达水平最高的过表达株系（OE1、OE4）和表达水平最低的抑制株系（RS5、RS4）进行后续的功能分析。结果表明，PagHSF4过表达会抑制杨树株高生长与生物量积累、减少茎节数、增加茎粗、增大叶片面积（细胞数量增加，细胞大小不变）、减小气孔孔径、伸长叶柄长度，揭示了该基因对生长发育的精细调控作用。
图2. 不同杨树品系的生长表型和指标分析
图3. 不同杨树品系的叶片表型和指标分析
图4. 不同杨树品系叶片腹表皮的扫描电镜观察结果
图5. 不同杨树品系的叶柄表型和指标分析
图3. 不同杨树品系的叶片表型和指标分析
图4. 不同杨树品系叶片腹表皮的扫描电镜观察结果
图5. 不同杨树品系的叶柄表型和指标分析
为解析PagHSF4调控的杨树下游基因，作者对OE与WT株系的不同组织进行RNA-seq分析，发现叶柄中的差异表达基因（DEGs）数量最多（1648个），茎（1246个）、叶（625个）、芽（609个）、根（345个）次之。GO与KEGG分析显示，差异表达基因在与植物生长发育相关的多个生物学过程和分子功能中显著富集。在表型发生显著变化的组织（叶片、叶柄、茎）中，差异表达基因在植物激素信号转导通路中的富集更为明显，这表明植物激素在PagHSF4调控的杨树生长发育过程中可能发挥关键作用。
图6. 不同组织的RNA-seq分析
为解析PagHSF4的分子调控机制，研究团队采用DAP-seq技术进行全基因组结合位点分析，结果显示：
（1）结合位点特征：PagHSF4在杨树19条染色体上均有结合峰，且在基因外显子（32.1%）、内含子（28%）和启动子区域（11%）富集，尤其在转录起始位点（TSS）下游结合活性更高。
（2）识别关键基序：通过motif分析，发现PagHSF4可特异性结合两种热休克元件（HSE）——“KCTTCTAGAAV”和“AGAASMTTCYA”，这与HSF家族结合HSE调控下游基因的经典机制一致。
（3）靶基因功能富集：启动子区域共鉴定出2632个直接靶基因（DTGs）。这些基因显著富集于气孔关闭调控、系统获得性抗性、活性氧响应等通路。结合转录组（RNA-seq）数据，进一步筛选出7个核心靶基因（LHY2、PIF3、MBF1C、TCF1、MGD2、HMP41、TBL38），并通过RT-qPCR、酵母单杂交（Y1H）和荧光素酶（LUC）实验验证PagHSF4通过结合这些基因启动子的HSE元件，显著下调其表达。
其中，LHY2是杨树昼夜节律与休眠调控的关键基因，PIF3参与光信号与逆境响应，MBF1C和TCF1则与胁迫耐受相关，这些靶基因的发现为PagHSF4调控生长与胁迫响应的“桥梁作用”提供了分子依据。
（1）结合位点特征：PagHSF4在杨树19条染色体上均有结合峰，且在基因外显子（32.1%）、内含子（28%）和启动子区域（11%）富集，尤其在转录起始位点（TSS）下游结合活性更高。
（2）识别关键基序：通过motif分析，发现PagHSF4可特异性结合两种热休克元件（HSE）——“KCTTCTAGAAV”和“AGAASMTTCYA”，这与HSF家族结合HSE调控下游基因的经典机制一致。
（3）靶基因功能富集：启动子区域共鉴定出2632个直接靶基因（DTGs）。这些基因显著富集于气孔关闭调控、系统获得性抗性、活性氧响应等通路。结合转录组（RNA-seq）数据，进一步筛选出7个核心靶基因（LHY2、PIF3、MBF1C、TCF1、MGD2、HMP41、TBL38），并通过RT-qPCR、酵母单杂交（Y1H）和荧光素酶（LUC）实验验证PagHSF4通过结合这些基因启动子的HSE元件，显著下调其表达。
其中，LHY2是杨树昼夜节律与休眠调控的关键基因，PIF3参与光信号与逆境响应，MBF1C和TCF1则与胁迫耐受相关，这些靶基因的发现为PagHSF4调控生长与胁迫响应的“桥梁作用”提供了分子依据。
图7. 通过DAP-seq获得的杨树中PagHSF4全基因组结合位点
图8. RNA-seq与DAP-seq的联合分析
图9. PagHSF4对其下游靶基因调控作用的检测
植物激素是连接基因调控与表型变化的重要信号分子。基因表达分析表明，由PagHSF4介导的杨树生长变化，与多种激素响应及信号转导通路相关。作者通过激素代谢组学分析发现，在PagHSF4过表达的杨树各组织中，过表达PagHSF4导致各组织中多种激素水平升高，其中叶、叶柄、茎（表型差异最显著）变化最明显，且三者中JA、JA-Val显著上调，尤其茎中JA浓度远高于其他组织。差异表达基因（DEGs）和差异积累激素（DAHs）通路映射分析表明，过表达导致芽中激素信号转导通路中多个与生长发育相关的基因下调，或致株高降低；叶片中ABA通路ABF基因上调，或促气孔关闭；茎中JA合成相关酶基因上调，是JA大量积累的关键。
图10.PagHSF4介导的不同组织中激素含量的变化
图11. PagHSF4介导的信号通路
作者进一步探究了PagHSF4调控盐胁迫耐受性的作用与机制。表型分析发现，盐胁迫下，OE株系生长抑制更显著，表明PagHSF4负调控杨树盐胁迫耐受性。通过RNA-seq分析发现，盐胁迫下OE植株760个基因上调（富集于胁迫相关过程与通路）、299个基因下调（富集于生长发育相关过程与通路），且激素信号通路中促生长基因下调。以上结果表明，盐胁迫下，PagHSF4可能通过抑制杨树激素信号通路中促进生长发育的关键基因表达发挥负调控作用。激素代谢组分析显示，盐胁迫下OE植株叶片3种生长素类激素水平降低、JA类激素（除MEJA）升高，茎中JA类激素升高、SA降低、ACC增加，叶片ABA-ald积累；叶与茎中JA、JA-Val均升高，SA变化有组织差异。综上表明，JA类激素升高及叶片生长素降低可能是PagHSF4抑制杨树盐耐受性的关键。
图12. 不同杨树品系的盐胁迫耐受性分析研究总结
本研究系统解析了杨树B类HSF基因的功能，填补了木本植物B类HSFs调控生长发育的研究空白；通过DAP-seq技术构建了PagHSF4的直接靶基因网络，为转录因子研究提供了“基因结合 - 表达调控 - 表型变化”的完整证据链。为杨树分子育种提供了关键基因资源——通过精准调控PagHSF4表达，可在“生长速度”与“抗逆性”之间找到平衡，培育兼具速生和耐盐特性的优良杨树品种。
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