期刊：Advanced Science
影响因子：14.1
主要技术：snRNA-seq、snATAC-seq

导语
脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI）损害中枢神经系统，并由于活性氧（reactive oxygen species，ROS）而引起髓鞘退化，进一步阻碍功能的恢复。基于铈（Ce）掺杂的上转换抗氧化纳米酶，设计了用于SCI的同时紧急治疗和动态发光严重性评估（SETLSA）策略（Ce@UCNP-BCH）。 Ce@UCNP-BCH不仅可以有效地消除SCI局部的ROS，而且可以使用比率发光信号动态监测SCI修复过程中的氧化状态。经典basso小鼠量表评分和免疫荧光分析共同显示Ce@UCNP-BCH有效促进包括髓鞘在内脊髓的再生，并促进SCI小鼠的功能恢复。本研究结合snATAC-seq和snRNA-seq揭示了Ce@UCNP-BCH治疗后脊髓组织的异质性。研究结果揭示了髓鞘形成的少突胶质细胞显著增加，以及髓鞘形成相关基因的表达增加，该研究还揭示了治疗后髓鞘再生的基因调控动力学。此外，ETLSA策略在SOD-siRNA治疗后通过超氧化物歧化酶（SOD）相关途径协同促进ROS消耗。总之，这种同时阻断和动态监测氧化应激的SETLSA策略丰富了促进SCI修复的工具包。

主要技术
scRNA-seq、snRNA-seq

研究结果
1. e@UCNP-BCH的合成与表征
透射电镜（TEM）显示，Ce@UCNP及其负载BCH后的Ce@UCNP-BCH均呈均匀的球形，尺寸约为100 nm，且形貌未发生明显改变。元素映射和X射线光电子能谱（XPS）证实了钇（Y）、镱（Yb）、铒（Er）和铈（Ce）的成功掺杂。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）证明了BCH特征官能团的存在，表明BCH已成功负载到纳米颗粒上。光谱分析表明，BCH的吸收峰（647 nm）与UCNPs在650 nm的发射峰高度重叠，满足了LRET的条件。当存在H₂O₂时，BCH的结构发生改变，吸收峰蓝移至414 nm，导致其对650 nm发光的淬灭效应解除，从而使I₆₅₀信号恢复，同时I₆₉₀信号减弱。这一变化构成了比率型荧光信号（I₆₅₀/I₆₉₀）的基础。通过H₂O₂清除实验和电子顺磁共振（EPR）波谱分析，证明Ce@UCNP-BCH能有效清除H₂O₂和超氧阴离子（O₂•⁻），且呈剂量依赖性。

Scheme 1.通过Ce@UCNP-BCH改善SCI促进了实时发光和单细胞多组学评估

Fig 1. Ce@UCNP-BCH的特性数据

2. CeO2 NPs和Ce@UCNP的体外ROS清除性能和神经保护能力
研究在细胞层面系统评估了纳米材料的生物活性。CCK-8实验表明，CeO₂ NPs、Ce@UCNP及Ce@UCNP-BCH在有效浓度范围内对HT-22细胞和海马神经元无明显毒性。在谷氨酸损伤的HT-22细胞模型中，DCFH-DA和DHE染色显示，CeO₂ NPs和Ce@UCNP均能显著降低细胞内ROS和O₂⁻水平。对损伤后的海马神经元，CeO₂ NPs和Ce@UCNP处理能显著增加神经突起的长度和分支数量，其中CeO₂ NPs在10 μg/mL、Ce@UCNP在1.5-3 μg/mL时效果最佳。在受损程度不同的神经元中，Ce@UCNP-BCH的荧光信号（I₆₅₀/I₆₉₀）能准确反映细胞内ROS水平的变化。同时，它同样展现出促进神经突起再生的能力，实现了“在治疗中监测，在监测下治疗”。

Fig 2. 用Ce@UCNP-BCH检测氧化还原状态和恢复神经行为

3. Ce@UCNP-BCH的上转换发光成像和体内活性氧清除
在小鼠SCI模型中，Ce@UCNP-BCH的综合治疗效果得到全面验证。向SCI小鼠腹腔注射Ce@UCNP-BCH后，通过活体成像系统监测损伤部位的荧光信号。结果显示，在损伤后24小时内，I₆₅₀/I₆₉₀比值持续升高，并于24小时达到峰值，直观反映了损伤部位ROS的动态累积过程。利用L-012化学发光探针进行在体成像，发现Ce@UCNP和Ce@UCNP-BCH治疗组小鼠损伤部位的ROS信号强度显著低于损伤组，证明其强大的体内抗氧化能力。ELISA检测显示，治疗组小鼠血清中的促炎细胞因子（IL-6, TNF-α, IL-1β）水平显著降低。治疗组小鼠的后肢运动功能评分显著高于损伤组。治疗组小鼠的运动速度和总移动距离显著增加。治疗组小鼠的步长和步宽均更接近正常小鼠，表明其步态得到明显改善。对脊髓组织的直接观察为功能恢复提供了形态学证据。H&E和LFB染色显示，与损伤组相比，治疗组的脊髓组织空洞更小，结构更完整，髓鞘保留得更多。TUNEL染色显示，治疗组损伤部位的凋亡细胞数量显著减少。NeuN/BrdU共染色显示，治疗组中成熟的神经元（NeuN⁺）和新增殖的神经元（BrdU⁺）数量更多，表明Ce@UCNP-BCH不仅能保护现有神经元，还能促进神经再生。NFH/GFAP共染色显示，治疗组中神经丝（NFH，标记神经元轴突）的信号增强，而胶质纤维酸性蛋白（GFAP，标记活化的星形胶质细胞，形成胶质瘢痕）的信号减弱，说明治疗创造了更利于轴突再生的微环境。

Fig 3. Ce@UCNP-BCH的体内ROS清除和治疗作用

4. 脊髓损伤后细胞分子变化与治疗的对比分析
以往的实验结果已经证明了Ce@UCNP-BCH治疗SCI的整体疗效，包括促进脊髓修复、改善运动功能、清除ROS等，然而，SCI后，组织内的原位异质性增加。存在的细胞亚群可能表现出不同的反应和恢复能力。为了阐明Ce@UCNP-BCH，来自假手术、损伤和治疗组的小鼠用于收集亚急性期（10 dpi）的脊髓用于snATAC-seq和snRNA-seq（BGI DNBelab C4）。实施了标准的数据预处理程序。最后，经过严格的质量控制和过滤，snATAC-seq中获得129549个细胞，snRNA-seq中获得39442个细胞。在snRNA-seq中鉴定了31种细胞类型，在snATAC-seq中鉴定了33种细胞类型。贝叶斯模型分析显示，与损伤组相比，治疗组中髓鞘形成少突胶质细胞（MFOLs） 的数量显著增加。这表明治疗有效促进了髓鞘的再生。热图分析显示，治疗组MFOLs中髓鞘相关基因（Plp1, Apod, Trf） 和神经再生相关基因（Bdnf） 的表达显著上调。GSEA表明，治疗激活了氧化磷酸化、心肌收缩等代谢通路，为轴突再生和髓鞘合成提供了充足的能量。

Fig 4. 脊髓单细胞图谱以及不同条件下细胞类型和基因表达的差异

5. Ce@UCNP-BCH促进神经元再生和髓鞘形成
通过整合snATAC-seq和snRNA-seq数据，发现治疗虽然未显著改变Olig1等关键基因启动子区的染色质可及性，但可能通过激活转录因子（如Sp1, Klf7, Egr1）的活性，从而在转录后水平上调了这些基因的表达，驱动了髓鞘再生。

Fig 5. 处理后髓鞘再生的基因调控动力学

6. Ce@UCNP-BCH的治疗作用机制
通过蛋白组学和功能丧失/获得实验，锁定了关键分子靶点。通过LC-MS/MS比较损伤组与治疗组的蛋白表达谱，发现超氧化物歧化酶2（SOD2）是唯一一个在“细胞氧化解毒”、“对氧水平升高的反应”和“氧化应激导致的细胞死亡”三条通路中均出现差异表达的蛋白。Western blot和免疫荧光证实，在损伤组中SOD2蛋白表达量代偿性升高，而在治疗组中其表达量回落至接近正常水平，提示Ce@UCNP-BCH通过增强SOD2的酶活性而非促进其表达来清除ROS。在海马神经元中过表达SOD2，能模拟Ce@UCNP-BCH的神经修复作用，且两者联合使用时效果更佳。使用SOD2-SiRNA敲低SOD2或抑制剂2-MeOE2后，Ce@UCNP-BCH的治疗效果被显著削弱。电生理学检测也显示，抑制剂处理阻断了治疗带来的运动诱发电位（MEP）振幅的改善。

Fig 6. Ce@UCNP-BCH体外神经修复行为的机制研究

参考文献：
Wang K, Zheng J, Li R, Chen T, Ma Y, Wu P, Luo J, Zhu J, Lin W, Zhao M, Yuan Y, Ma W, Lin X, Wang Y, Liu L, Gao P, Lin H, Liu C, Liao Y, Ji Z. Single-Cell Multi-omics Assessment of Spinal Cord Injury Blocking via Cerium-doped Upconversion Antioxidant Nanoenzymes. Adv Sci (Weinh). 2025 Feb;12(8):e2412526. doi: 10.1002/advs.202412526. Epub 2025 Jan 9. PMID: 39783786; PMCID: PMC11848599.