293T细胞被广泛应用于瞬时转染以过表达各种重组蛋白或病毒包装，其优点包括高转染效率、低成本的放大性和人糖基化模式^[1]。随着基因治疗和细胞治疗的飞速发展，293T细胞越来越多地应用于腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体，重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）载体及慢病毒的生产^[2]。为实现更大规模的GMP生产要求以满足基因治疗、细胞治疗领域相关研发和临床实验，越来越多的研究人员将目光转向了生物反应器工艺。

从培养箱到生物反应器工艺过程中，有三大挑战。首先，293T原本是贴壁细胞属性，需要贴附在载体表面进行生长。目前最常用的贴壁载体为Cytodex1球状载体，如Vero细胞在这个体系下细胞密度可达到1.0×10⁷ cells/mL以上。但293T细胞的贴壁牢固性较Vero细胞这类贴壁细胞弱，在微载体搅拌的过程中会导致细胞的脱落和死亡，因此在生产应用中仍有所限制。其次，贴壁的293T细胞在生长过程中需要添加血清等动物源成分，影响了后期的质量控制。最后，贴壁细胞在逐级放大过程中受到细胞消化效率的限制。面对这些挑战，有研究人员将293T细胞驯化成无血清悬浮细胞株，解决了以上问题，但细胞密度只能在10⁶ cells/mL水平^[3]。

生物反应器作为大规模动物细胞培养的有利工具，已经被应用到293T悬浮培养工艺中。然而通常的批次模式下，营养成分的耗竭及代谢副产物的积累往往限制细胞生长及代谢，流加（Fed-batch）培养工艺因其操作简单、过程放大容易、重复性高等优点已成为动物细胞大规模培养的主流模式。因此我们用293T 悬浮细胞在CloudReady™ 500mL生物反应器系统上进行了Fed-batch 培养，为293T悬浮细胞高密度表达提供参考（图1），为病毒载体生产工艺提供新的可行性。
 

图1 CloudReady™ 500mL生物反应器系统

操作过程

本次实验以5×10⁵ cells/mL的细胞密度接种，将空气和氧气级联DO，CO₂ 和 0.5 mol/L NaOH溶液级联pH。其他参数控制和补料控制见表1和表2。另外，在第八天根据细胞实际情况又额外补加了10mL 293瞬转表达用补料A和1mL 293瞬转表达用补料B。

表1 工艺控制参数设定

 

结果

本次实验进行了长达217h的培养周期，经过上述条件的控制，最终细胞密度达到了2.28×10⁷ cells/mL，并且活率维持在93%以上（图2）。实验过程中没有通入0.5 mol/L NaOH溶液，pH最低值维持在6.7以上（图3）。根据CARE（迪必尔生物应用技术与工程研究中心）前期培养293T细胞的经验，pH控制在6.9-7.3，会造成大量的乳酸积累，培养期间持续增加至4.41g/L^[4]

此次实验通过降低了pH设定值，乳酸浓度最大不超过2g/L，最后稳定在1.5g/L左右（图4）。这样的结果给下一步利用微小型平行生物反应器进行工艺优化提供了一定的参考。
 

图2 239T细胞培养过程增殖曲线,“Fed”指补加293瞬转表达用补料A和B两种培养基。


图3 293T细胞培养周期参数控制趋势图：红色-温度；黑色-pH;绿色-DO；黄色-转速（rpm）；蓝色-CO₂流速（mL/min）；灰色-空气流速（mL/min）；橙色-氧气流速（mL/min）。


图4 239T细胞培养过程葡萄糖消耗曲线和乳酸盐代谢曲线。

参考文献

[1]. DEKEVIC G, TASTO L, CZERMAK P, et al. Statistical experimental designs to optimize the transient transfection of HEK 293T cells and determine a transfer criterion from adherent cells to larger-scale cell suspension cultures [J]. J Biotechnol, 2022, 346: 23-34.

[2]. ABAANDOU L, QUAN D, SHILOACH J. Affecting HEK293 Cell Growth and Production Performance by Modifying the Expression of Specific Genes [J]. Cells, 2021, 10(7).

[3]. TANG Q, GU L, WU H, et al. Establishing 293T suspension cultrue for lentiviral vector production in a stirred bioreactor [J]. 2020.

[4]. 汪兴. HEK 293T细胞在一次性生物反应器（3L）的悬浮培养工艺. 迪必尔生物工程（上海）有限公司. 2023

CloudReady™云平台生物反应器（图5）整合了多种补料策略，同时内置DoE实验设计与分析软件可以帮助用户快速地进行布局实验，缩短产品的开发周期。

图5 CloudReady™ 第6代平行生物反应器