一 重磅科研进展
德国 FBN 动物生理研究所团队依托CERO 3D 一体化孵育生物反应器，全球首次建立无支架原代猪肌细胞（PMC）3D 肌球（myosphere）标准化培养体系，同步对比经典 C2C12 小鼠成肌细胞球特征，解决原代肌干细胞 3D 培养易失干性、难以规模化、重复性差等痛点，为肌肉再生医学、肉类细胞培养、肌肉疾病药物筛选提供更贴近人体生理的大动物体外 3D 模型。
 

图1. CERO生物反应器设备和反应器容器示意图

二 研究背景：骨骼肌 2D 培养先天缺陷，肌球 3D 模型需求迫切
骨骼肌是人体占比最高组织，肌卫星干细胞（成肌前体细胞）是肌肉修复、肌病研究、细胞培养肉研发核心工具。 传统二维单层培养存在致命短板：脱离干细胞微环境后，肌卫星细胞极易提前分化、丢失干性，无法还原体内细胞外基质、细胞间信号互作；静态悬浮、悬滴法等传统 3D 造球手段操作繁琐、批次差异大、难以放大，且多局限于小鼠细胞系，缺少大动物原代标准化方案。

猪肌肉生理结构、代谢模式与人类高度同源，是理想临床前模型，但此前尚无猪原代肌细胞无支架 3D 肌球培养体系；现有生物反应器多依赖水凝胶、微载体等支架材料，存在免疫原性、杂质污染、操作复杂等问题，严重限制肌肉 3D 模型推广应用。

核心痛点：缺少适配原代肌细胞、低剪切力、可平行化、无支架的中试级动态 3D 培养平台，制约肌肉发育、肌损伤修复、肌病药物筛选研究！

三 技术创新：CERO 全自动3D细胞培养仪，双向旋转，24h 快速成球，7 天稳定培养原代猪肌球
本研究采用商用 CERO 3D 孵育反应器，搭载 4 根独立可控培养管，管壁微型匀流鳍替代搅拌桨，双向往复旋转实现细胞悬浮悬浮悬浮漂浮，大幅降低剪切力损伤敏感原代肌细胞；全程无支架、无需额外水凝胶 / 微载体，一套设备同步平行培养多组样本，标准化程度拉满。

整套标准化培养流程:
1. 原代猪肌细胞分离扩增 选取 4 日龄德国长白仔猪半膜肌、背最长肌，胰酶消化 + Percoll 梯度离心纯化原代猪肌细胞（PMC），I 型胶原包被培养瓶 2D 扩增 3–4 代；对照组 C2C12 小鼠成肌细胞常规传代培养。
2. 反应器接种分阶段程序调控 C2C12 接种密度 2×10⁵个/mL，猪原代肌细胞接种密度 1×10⁵个/mL，单管培养体积 10mL；设置接种阶段 + 维持培养阶段两套旋转程序，转速统一 80rpm，仅调整旋转周期、间歇静置时长，适配两种细胞聚集特性：

表1. 使用CERO 3D生物反应器进行悬浮培养的参数

3. 7 天全程动态培养，24h 即可形成完整致密肌球 不同于静态培养需 3–4 天才形成紧实细胞聚团，CERO 动态体系下接种 24h 两种细胞均形成规则球形肌球，可持续稳定培养至少 7 天，细胞活力全程维持高水平。

四 两种肌球核心生长参数对比（关键量化结果）
1. 尺寸差异 C2C12 肌球平均直径 44.6μm，猪原代肌球 32.7μm；两类细胞球最大直径均可突破 1mm，50% 肌球集中分布在 22–39μm 区间。
2. 数量与细胞堆积密度 同等培养体系下，猪原代肌细胞形成的肌球数量显著更多；但 C2C12 肌球细胞堆积密度更高（中位 4.05 个细胞核 /mm²，PMC 仅 2.89 个细胞核 /mm²），高密度促使 C2C12 在球内提前发生成肌融合。
3. 融合特征 C2C12 肌球内部大量出现多核肌合胞体，球内即可启动成肌分化；猪原代肌球无自发融合，细胞维持更原始干祖细胞状态。

图2. 在CERO中培养的肌球体

五 分子与活细胞验证：猪原代肌球自产胞外基质，细胞无凋亡、干性完整保留
1. 组织学与成肌标志物染色

• 冷冻切片免疫荧光结果揭示两类肌球分化阶段差异： C2C12 肌球：完整表达结蛋白 Desmin、F - 肌动蛋白 F-Actin、肌球蛋白重链 MHC，球内提前发生终末成肌分化；
• 猪原代肌球：广谱表达肌干细胞标志物 Desmin，仅少量细胞表达 MHC，几乎无 F-Actin；优势在于可自主分泌 Ⅰ/Ⅲ 型胶原蛋白，复刻体内肌肉天然胞外基质微环境，这是细胞系球不具备的特征。

2. 细胞活死 / 凋亡检测（共聚焦成像）
Calcein-AM 活细胞、PI 死细胞、Annexin V 凋亡三重染色验证：

• 培养 7 天两类肌球均无大量坏死核心；
• 猪原代肌球完全未检出凋亡信号；C2C12 仅存在微弱凋亡背景信号，远低于甲醇阳性对照组； 动态生物反应器持续流体交换，解决静态培养扩散不足导致的球体中心坏死难题。

图4. 肌球体中的细胞存活率
 

3. 解离后成肌潜能验证（核心结论）
将培养 5 天的肌球解离为单细胞，铺板 2D 诱导分化：

• 两类细胞均可快速贴壁、Ki67 增殖标志物阳性，重新进入细胞周期；
• 血清减量诱导分化后，均形成多核肌管，稳定表达 MyoG、Desmin、肌球蛋白；
• C2C12 分化效率更高、肌管更长；猪原代肌细胞虽传代多次，仍完整保留成肌分化潜能，适合大动物再生相关研究。

图5. 从肌球体中分化出的细胞的肌源性分化

六 技术核心优势，优于传统 3D 造球方案

• 无支架培养，规避材料干扰 无需胶原、水凝胶、微载体等外源基质，排除生物材料免疫原性、杂质干扰，简化实验变量，适配后续体内移植、药物筛选。
• 低剪切力，适配脆弱原代干细胞 双向柔和悬浮、无搅拌桨损伤，猪原代肌干细胞 7 天无凋亡、不丢失干性，传统搅拌瓶易造成原代细胞大量破损。
• 平行化中试规模，重复性拉满 单台设备 4 根独立培养管，可同时设置多梯度实验组；培养参数程序固化，批次差异远小于悬滴、静态低黏附板。
• 耗材人力成本更低，操作门槛友好 对比悬滴法上千次手动操作、极易污染；CERO 全程封闭孵育，中途取样简便，大幅减少人工操作与污染风险。
• 大动物原代模型独家方案 全球首次实现猪原代肌细胞稳定造球，猪生理与人高度相似，弥补小鼠细胞系转化局限性，适配细胞培养肉、临床前肌病研究。

表2.方案横向对比：CERO 动态生物反应器 vs 传统 3D 肌球培养

七 多元应用场景，覆盖基础科研与转化前沿
1. 骨骼肌基础发育研究
肌卫星干细胞干性维持、细胞外基质互作、成肌分化调控机制解析；对比 2D 培养，3D 肌球完美还原体内细胞聚集与信号梯度。

2. 肌肉疾病模型与药物筛选
肌营养不良、肌肉萎缩、创伤性肌损伤体外模型；用于抗炎、促肌肉修复药物高通量筛选，减少动物实验使用。

3. 再生医学与细胞移植研究
肌球可作为 “模块化组织单元”，用于肌肉组织工程、细胞移植前体外扩增，猪原代模型支撑临床前大动物预实验。

4. 细胞培养肉研发
猪原代肌球无支架规模化扩增体系，为体外培养肉的细胞规模化生产提供成熟动态培养工艺参考。

总结：填补大动物原代肌肉 3D 培养空白，CERO 反应器搭建标准化肌球研究平台

该研究首次建立无支架、中试动态、可重复的猪原代肌球培养工艺，验证 CERO 双向旋转生物反应器可温和扩增敏感肌干细胞，培养过程中细胞完整保留增殖、成肌分化能力，且原代猪肌球可自主合成肌肉关键胞外基质胶原，弥补小鼠细胞系模型生理缺陷。

相较于传统静态、搅拌式 3D 培养手段，这套体系兼顾操作便捷性、细胞安全性、实验可重复性，为骨骼肌发育、肌肉疾病药物筛选、组织工程、细胞培养肉等领域提供标准化大动物 3D 体外模型；同时该平台通用性强，可拓展至其他原代干细胞、间充质细胞、类器官悬浮培养，为 3D 细胞实验标准化、规模化提供通用解决方案。

未来可进一步优化培养周期、培养基组分，实现猪肌球长期传代扩增，推动肌肉相关基础研究与转化医学加速落地！

参考文献
Stange K, Keric A, Friese A, et al. Preparation of Spheroids from Primary Pig Cells in a Mid-Scale Bioreactor Retaining Their Myogenic Potential. Cells, 2022, 11(9):1453. DOI:10.3390/cells11091453