五种常见的细胞增殖检测技术原理及实验流程分享
2023-12-05 来源: 点击次数:2601
细胞增殖实验常用方法包括细胞计数法、MTT法、BrdU染色法、CCK-8法、克隆形成法，这些实验通常需借助显微镜和分光光度计完成。以上方法需频繁拿出细胞，那么有什么新方法可以弥补这种不足呢？本文将介绍一种新的方法-使用活细胞成像系统，置于培养箱内实时动态成像，监测细胞的增殖情况。我们分析了新方法对比常用方法的优势，同时列举了几篇活细胞成像系统应用在细胞增殖方向的发表在《Nature communications》、《Science translational medicine》、《Cell Reports》期刊的高分文章，该方法获得了高校老师的认可，且在细胞增殖实验中被推广使用，证实了新方法的可靠性。
细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础，细胞以分裂的方式进行增殖。
细胞增殖能力是细胞活性的直接表现。
细胞增殖检测技术广泛应用于分子生物学、肿瘤生物学、药理和药代动力学等研究领域。 常见的细胞增殖检测方法有以下5种。
1.细胞计数法
细胞增殖表现为细胞数目的增多，通过计数板和细胞计数仪得出细胞数目，绘制生长曲线。
操作方法：一般过程为接种细胞，分组培养7天，逐日检测细胞数量，根据细胞数量绘制成图，即为细胞生长曲线。
不足：操作繁琐，需频繁将细胞拿出培养箱，不适合数量较多或特定亚群的细胞计数。
2.MTT法
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
简易流程：
2.1、接种细胞：制备细胞悬液，将细胞接种到多孔板中。
2.2、培养细胞：培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。
2.3、呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液。继续孵育，加DMSO，使结晶物充分融解。
2.4、比色：在 490nm波长下检测吸光值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
不足：工作量大，且溶解甲瓒的有机溶剂有毒性，对细胞造成损伤。
3. BrdU染色法
BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中（细胞周期S期）。通过检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。
简易实验流程如下：
3.1、对细胞进行接种，根据不同条件进行药物处理。
3.2、制备适量BrdU培养基，孵育。除去培养液，用PBS洗涤。
3.3、加入多聚甲醛常温固定，PBS冲洗。
3.4、加入含 Triton X-100的PBS，在冰上将细胞膜穿刺，加入预冷的PBS冲洗。
3.5、加1抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1：50)，阴性对照加PBS或血清。
3.6、按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜或活细胞成像系统下拍照。
不足：破坏细胞结构，准确性较低
4. CCK-8法
CCK-8试剂中含有WST–8，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的Formazan。用酶标仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
4.1、将处理过的细胞胰酶消化后计数，接种1000个细胞至96孔板，每孔100 μL培养基，将培养板置于培养箱中培养0 h、24h、48h和72h。
4.2、每孔加入10 μL CCK-8溶液，用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。
4.3、在细胞培养箱内继续孵育0.5h，用酶标仪在450nm测定吸光度。
不足：CCK-8价格较贵，且试剂颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，操作过程中容易多加或漏加。
5. 克隆形成法
细胞在体外增殖，形成集落，集落的大小和数量反应该细胞独立生存能力和增殖能力，从而反映细胞增殖的情况。
实验流程：
5.1、接种细胞于六孔板中，轻轻混匀后放入培养箱中培养。
5.2、培养过夜后，根据实验目的加入药物或其他处理。
5.3、每隔一定时间更换一次培养基，培养2周后，去除培养基，加入PBS洗一次。
5.4、加入多聚甲醛或者乙醇固定，去除培养基，加入结晶紫染色液，常温染色。
5.5、加入PBS洗3次，将六孔板放入烘箱中烘干，对克隆细胞进行计数和拍照。
不足：培养时间长，操作繁琐，频繁取出观察，影响细胞生长环境。
综上所述，传统的细胞增殖检测方法，操作繁琐，需频繁将细胞拿出培养箱，且个别试剂会对细胞结构造成影响。耗时、耗力、实验成功率不能保证，最终影响实验效率。
那么，有什么新工具可以弥补这些不足，助力细胞增殖实验呢？持续关注奎克泰生物，下篇文章将继续为您科普细胞增殖知识~
细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础，细胞以分裂的方式进行增殖。
细胞增殖能力是细胞活性的直接表现。
1.细胞计数法
细胞增殖表现为细胞数目的增多，通过计数板和细胞计数仪得出细胞数目，绘制生长曲线。
操作方法：一般过程为接种细胞，分组培养7天，逐日检测细胞数量，根据细胞数量绘制成图，即为细胞生长曲线。
不足：操作繁琐，需频繁将细胞拿出培养箱，不适合数量较多或特定亚群的细胞计数。
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
简易流程：
2.1、接种细胞：制备细胞悬液，将细胞接种到多孔板中。
2.2、培养细胞：培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。
2.3、呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液。继续孵育，加DMSO，使结晶物充分融解。
2.4、比色：在 490nm波长下检测吸光值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
不足：工作量大，且溶解甲瓒的有机溶剂有毒性，对细胞造成损伤。
3. BrdU染色法
BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中（细胞周期S期）。通过检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。
简易实验流程如下：
3.1、对细胞进行接种，根据不同条件进行药物处理。
3.2、制备适量BrdU培养基，孵育。除去培养液，用PBS洗涤。
3.3、加入多聚甲醛常温固定，PBS冲洗。
3.4、加入含 Triton X-100的PBS，在冰上将细胞膜穿刺，加入预冷的PBS冲洗。
3.5、加1抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1：50)，阴性对照加PBS或血清。
3.6、按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜或活细胞成像系统下拍照。
不足：破坏细胞结构，准确性较低
4. CCK-8法
CCK-8试剂中含有WST–8，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的Formazan。用酶标仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
4.1、将处理过的细胞胰酶消化后计数，接种1000个细胞至96孔板，每孔100 μL培养基，将培养板置于培养箱中培养0 h、24h、48h和72h。
4.2、每孔加入10 μL CCK-8溶液，用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。
4.3、在细胞培养箱内继续孵育0.5h，用酶标仪在450nm测定吸光度。
不足：CCK-8价格较贵，且试剂颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，操作过程中容易多加或漏加。
5. 克隆形成法
细胞在体外增殖，形成集落，集落的大小和数量反应该细胞独立生存能力和增殖能力，从而反映细胞增殖的情况。
实验流程：
5.1、接种细胞于六孔板中，轻轻混匀后放入培养箱中培养。
5.2、培养过夜后，根据实验目的加入药物或其他处理。
5.3、每隔一定时间更换一次培养基，培养2周后，去除培养基，加入PBS洗一次。
5.4、加入多聚甲醛或者乙醇固定，去除培养基，加入结晶紫染色液，常温染色。
5.5、加入PBS洗3次，将六孔板放入烘箱中烘干，对克隆细胞进行计数和拍照。
不足：培养时间长，操作繁琐，频繁取出观察，影响细胞生长环境。
综上所述，传统的细胞增殖检测方法，操作繁琐，需频繁将细胞拿出培养箱，且个别试剂会对细胞结构造成影响。耗时、耗力、实验成功率不能保证，最终影响实验效率。
那么，有什么新工具可以弥补这些不足，助力细胞增殖实验呢？持续关注奎克泰生物，下篇文章将继续为您科普细胞增殖知识~
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