整合单细胞RNA测序和空间转录组学描绘癌前病变到侵袭性肺腺癌的演变
2024-04-30 来源:本站 点击次数:2192
期刊：Theranostics
影响因子：12.4
主要技术：snRNA-seq、ST-seq、RNA-seq
导语
本研究运用运用单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 和空间转录组学(ST)的综合分析，表征肺腺癌（LUAD）侵袭过程中的动态和连续过程中涉及的细胞生态和空间生态位。研究发现，UBE2C+癌细胞亚群在LUAD侵袭过程中不断增加，其空间分布在浸润性腺癌（IAC）的周边癌区域。此外，对TME细胞类型亚群的分析显示肥大细胞、单核细胞和淋巴内皮细胞不断减少，这些细胞参与了侵袭性LUAD的整个过程。同时，从原位腺癌（AIS）到微浸润腺癌（MIA）的NK细胞和MALT B细胞的增加，从MIA到IAC，Treg 细胞和分泌性B细胞有所增加。值得注意的是，对于AIS，癌细胞、NK 细胞和肥大细胞共定位于癌症区域，对于IAC，Tregs 与癌细胞共定位。最后发现，癌细胞与TME细胞诱导的TGF-β信号通路的通讯和相互作用参与了IAC的侵袭。研究结果揭示了癌细胞和TME亚群的特定细胞信息和空间结构，以及它们之间的细胞相互作用，这将有助于在LUAD从AIS到IAC的侵袭过程中精准医学的识别和发展。
研究技术
snRNA-seq、ST-seq、RNA-seq
研究结果
1. LUAD细胞类型鉴定及侵袭过程中的差异表达基因
收集AIS、MIA 、IAC各3个样本进行scRNA-seq测序（图1A），经过质控总共获得了 115,246 个细胞，大致分为C1到C10的10 个细胞谱系，其中6种细胞类型由经典的基因定义，包括上皮细胞、T/NK细胞、B 细胞、骨髓细胞、内皮细胞 、成纤维细胞（图1B-C）。使用IF来校准细胞的基因标记物的表达(图1D)。为进一步探讨LUAD侵袭过程的机制，研究人员比较了每种细胞类型的基因表达模式，MIA和AIS (M/A)组之间有512个上调和332个下调的DEG，IAC和MIA (I/M)组之间有199个上调和347个下调的 DEG，IAC和AIS (I/A)组之间有393个上调和345个下调DEG。值得注意的是，I/A 组中大约一半上调的DEG在M/A 组中已经可检测到（图1E-F）。DEG 的PCA 显示MIA和IAC在转录组水平上非常接近（图1G），进一步分析揭示了LUAD 三个不同阶段的丰富细胞类型（图1H）。
图 1
2. 上皮细胞的亚群鉴定及LUAD的起源为确认启动 LUAD 侵袭的关键癌细胞亚簇，将上皮细胞进一步重新聚类为8个亚群，包括Clara-like、TM4SF1+、CRABP2+、UBE2C+4个癌细胞亚群和肺泡I型、肺泡II型、Clara细胞 、纤毛细胞4个正常上皮亚群，以内皮细胞为参考进行CNV分析（图2A-B）。相对于另外两个癌细胞亚群，TM4SF1+和UBE2C+的癌细胞亚群比例在LUAD侵袭过程中不断增加，在IAC中急剧升高，并且从AIS到MIA，UBE2C +亚型的比例变化比TM4SF1+亚型更明显（图2C）。IF 和bulk RNA-seq的结果也证实UBE2C +亚型癌细胞从AIS逐渐稳定地增加到IAC（图2D-E）。研究人员，通过TCGA-LUAD数据库验证了UBE2C+癌细胞对LUAD患者预后的影响，发现它可以作为预测LUAD预后的生物标志物（图2F）。利用ssGSEA分析发现，UBE2C+癌细胞主要富集MYC靶点V1、细胞周期、AKT和TGF-β信号通路等基因集，这些细胞可能通过这些途径促进癌症的进展（图2G）。接下来，运用拟时序分析来破译LUAD从正常上皮细胞到癌细胞的细胞轨迹，以揭示LUAD的起源，结果表明，UBE2C+癌细胞作为分化最差的癌细胞类型和终末细胞类型（图2H）。
图 2
3. UBE2C+细胞亚群参与LUAD 的整个侵袭过程为进一步了解UBE2C+癌细胞，使用bulk RNA-seq数据验证UBE2C表达水平在LUAD的三个阶段逐渐增加（图3A）。结合TCGA数据集发现UBE2C高表达的患者无进展生存期和总生存期较差（图3B）。体外实验证实UBE2C通过影响LUAD增殖和侵袭来介导LUAD的恶性进展（图3C-D）。此外，体内实验表明UBE2C沉默显着减弱了皮下肿瘤的生长（图3E-G）。这些结果表明UBE2C介导LUAD细胞的增殖和转移。
图 3
4. LUAD侵袭中不同TME细胞亚群的研究为了探索不同TME细胞类型在LUAD侵袭过程中的变化，对主要TME细胞群进行了进一步研究。对T/NK细胞重新聚类为8个亚群、骨髓细胞重新聚类为10个亚群（图4A）。结果发现，TPSB2 +肥大细胞和FCN1 +单核细胞占比从AIS和MIA到IAC逐渐持续下降，GNLY +NK细胞占比仅从AIS到MIA增加，而FOXP3 +Tregs的丰度从MIA到IAC显着升高（图4B）。通过bulk RNA-seq和IF进一步证实了细胞亚群变化的情况（图4C-D）。接下来使用GSVA些细胞亚群变化中涉及的潜在标志信号通路，细胞周期和细胞生长或增殖相关途径，如PI3K/AKT/MTOR信号等在GNLY+NK和Foxp3+NK中高度富集，WNT和干扰素信号等在TPSB2 +肥大细胞和FCN1+单核细胞富集（图4E-F）。因此，研究人员提出Tregs 增加和单核细胞减少介导的肿瘤相关通路的激活可促进早期LUAD侵袭。
图 4
5. TGF-β信号通路在晚期LUAD的侵袭中发挥关键作用CellChat分析结果揭示了LUAD中细胞之间的前十个相互作用途径（图5A）。在AIS和MIA中没有观察到癌细胞和TME细胞之间通过TGF-β信号传导进行的通讯，但这种相互作用在IAC中显着加强，特别是在NK、肥大和MALT B细胞中，与之前的结果一致（图5B)。进一步的分析发现，与AIS和MIA相比，癌细胞和TME细胞中TGF-β配体的水平在IAC中广泛上调（图5C）。同样的，下游靶基因以及TGF-β途径的下游因子p-SMAD2的表达水平在IAC中高度激活（图5D-E）。这些结果意味着癌细胞和TME细胞之间TGF-β信号传导的通讯和相互作用在IAC中诱导的TGF-β信号传导的无限制激活可能在晚期LUAD的侵袭中发挥关键作用。
图 5
6. 癌症区域Tregs的空间分布介导LUAD侵袭通过scRNA-seq分析的AIS、MIA、IAC各2个样本进一步进行 ST。基于HE染色，将样本分为四个不同的组织学区域，包括癌区域、正常上皮区域、基质区域和淋巴区域（图6A）。AIS样本TD8通过ST分为四个区域（图6B），通过marker基因的表达进一步证实了空间划分的准确性（图6C）。如预期，TM4SF1+癌细胞、GNLY+NK细胞、NKG7+NK和TPSB2+肥大细胞在癌症中共定位，但未发现FOXP3+ Tregs（图6D）。同样研究了两例IAC 对应的空间和细胞数据，ST也清晰的区分四个区域，与HE染色结果高度一致（图6A-B）。TM4SF1 + 癌细胞和 UBE2C+癌细胞在癌症区域富集，CAF（Fib-1）和 FOXP3+Tregs与癌细胞亚群共定位（图6D）。与AIS相比，IAC的癌症脉管系统区域呈现出更明显的血管数量和更高表达水平的VEGFs与正常的区域相比，相反，AIS没有明显的差异（图6E-G）。这一发现表明血管生成可能对 LUAD 的侵袭过程有显着贡献。
图 6
7. 边缘癌区域比ST分析的中心癌区域更活跃为了进一步了解scRNA-seq确定的四个癌症亚群的空间分布和生物学意义，研究人员将癌症区域重新聚集为亚区。AIS的TD8样本，由中央区(黑色)和外围区域(红色)组成(图7A)。结果发现，Clar-like癌细胞在外围区域高度富集，中央区域以TM4SF1+癌细胞为主(图7B)。Wnt/β-Catenin、血管生成通路等致癌信号在外围区域高度(图7D)。值得注意的是，与TGF-β信号通路相关的基因在中心区域高表达(图7E），增殖指数在外围区域高表达(图7F)。在MIA中，区域的富集与AIS类似。但是富集途径不同，EMT通路在外周区域2高度激活，而在中央区域0处于惰性状态(图7D)。最后，分析IAC样本，中心区域和外围区域都高度富集TM4SF1+癌细胞和UBE2C+癌细胞，特别是区域5，TGF-β信号通路相关的基因在癌区5高表达（图7C-E）。总之，这些发现表明UBE2C+癌细胞亚群在驱动AIS 到 MIA过程中起着至关重要的作用，癌细胞与TME之间的TGF-β信号相互作用以及调节免疫逃逸的空间变化与LUAD侵袭有关（图 7G）。
图 7
参考文献：
Zhu J, Fan Y, Xiong Y, et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Exp Mol Med. 2022 Nov;54(11):2060-2076. doi: 10.1038/s12276-022-00896-9. Epub 2022 Nov 25. PMID: 36434043; PMCID: PMC9722784.
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