本项重要研究成果由Mark Tingey, Andrew Ruba, Samuel L. Junod, Coby Rush, Jason Saredy, William E. Brew和Weidong Yang共同完成。研究论文题为“Paired-objectives photon enhancement(POPE) microscopy: enhanced photon collection for fluorescence imaging”，已于2025年8月在《Communications Engineering》上正式在线发表。

重要发现
01核心光学原理与系统设计
POPE显微镜的核心贡献在于其独特的光学架构，它直指传统荧光显微镜光子收集效率低下的根源。在常规的倒置或正置显微镜中，单个物镜只能收集样本一侧（通常是下方）发射的光子，其收集效率由数值孔径决定，即使使用高数值孔径物镜，也仅能捕获约四分之一的光子。POPE技术突破了这一限制，采用双物镜对称设计：主物镜（位于样本下方）负责提供激发光并收集向下发射的荧光；而另一个与之匹配的副物镜（位于样本上方）则专门用于捕获那些原本会损失掉的、向上发射的光子。

实现光子高效回收的关键是一个精密的4f光学中继系统。该系统由副物镜（作为第一透镜，焦距f₁）和一个复合透镜（焦距f₂）构成，两者间距为f₁ + f₂。此设计构成了一个望远系统，能够对捕获的光子波前进行傅里叶变换和逆变换，从而在保持波前空间完整性的前提下，将光子传导至一个反射率超过99.99%的平面介电反射镜上。光子经反射后，沿原路返回，再次通过4f系统和主物镜，最终与向下发射的光子在探测路径上合并。整个过程中，一个战略性地放置在透镜间的长通滤光片用于阻挡激发光，防止其反射回去造成样本的二次激发，从而有效隔离荧光信号并提升信噪比。这种闭循环设计确保了成像质量达到衍射极限，且在整个视场和焦平面内保持均匀。

定量分析表明，经过完美对齐后，结合POPE的点扩散函数与单物镜点扩散函数在形状上高度一致，其强度相关商数和皮尔逊相关系数分别达到0.4和0.8以上，证明了卓越的空间重叠度。尽管合并后的点扩散函数在横向和轴向上有轻微展宽（例如横向半高全宽从约296纳米增至320纳米以内），但其峰值强度却实现了近两倍的提升，这正是光子收集效率倍增的直接体现。这套系统的校准流程确保了POPE显微镜能够在最大化收集光子的同时，保持优异的成像质量。

04增强共聚焦与宽场成像能力
POPE技术的优势并不仅限于超分辨成像。在研究将其应用于共聚焦激光扫描显微镜时，在成像荧光微球和表达荧光蛋白的细胞样本中，POPE使检测到的荧光信号强度提升了1.8至1.9倍，这直接提升了共聚焦图像的信噪比和光学切片质量。同样，在宽场荧光成像模式下，对标记了特定蛋白的细胞进行成像，POPE也带来了约1.5倍的信号提升。尤为值得一提的是，在自发荧光成像中，即不依赖任何外源荧光标记、仅利用细胞内源物质（如黄素类分子）的微弱信号进行成像时，POPE在多种细胞系中均实现了1.3至1.5倍的信号增强，这对于活细胞、无标记观察细胞代谢状态等应用具有重要价值。

创新与亮点
POPE显微镜最突出的创新价值在于，它以一种相对简洁、模块化且易于实施的方案，成功解决了荧光显微镜领域长期存在的“光子浪费”这一根本性效率瓶颈。与那些需要复杂干涉光路、双通道探测或精密图像配准的双物镜技术不同，POPE的核心创新点在于巧妙地利用4f光学中继系统和反射镜，实现了将“损失”的光子高效回收并导入单一、标准的探测路径。这种设计哲学使其在提供高达两倍光子收集能力的同时，最大程度地降低了对现有显微镜平台的改造难度和成本，使其成为一种极具实用价值和推广潜力的“即插即用”式升级方案。

在技术层面，POPE的亮点在于其卓越的兼容性。它并非一种独立的成像模式，而是一个通用的信号增强平台。研究表明，它能够显著提升从纳米精度的单分子定位成像，到常规的共聚焦和宽场成像，乃至极具挑战性的自发荧光成像等多种技术的性能。这种“一专多能”的特性，意味着一个实验室只需添加POPE模块，就能使其核心成像设备在多种应用场景下获得性能飞跃，特别是在信噪比提升和成像速度加快方面，这对于观察快速生命过程或研究光敏感样本尤为重要。

从应用价值来看，POPE技术的意义深远。它直接提升了荧光成像的灵敏度极限，使得研究者能够探测到更微弱信号，从而可能观察到以往难以窥见的生物现象。在生物医学领域，这可以转化为更清晰的疾病相关亚细胞结构图像、更精确的活细胞内分子动力学追踪，以及更高质量的原位组织分析。此外，通过提升自发荧光成像能力，POPE为无标记、非侵入性的长期活细胞监测提供了新可能，这在药物筛选和细胞代谢研究中有广阔前景。最后，论文还前瞻性地指出，POPE的基本架构为未来进一步升级（如与双光子激发结合以提升穿透力，或改造为干涉测量模式以提升分辨率）预留了空间，展现出持续的技术生命力。

总结与展望
综上所述，POPE显微镜通过一种创新性的双物镜光子回收设计，成功地将荧光成像的光子收集效率提升至传统方法的近两倍。这项技术的核心优势在于其模块化、高兼容性和易用性，能够作为一项经济高效的升级方案广泛应用于现有的倒置显微镜平台，并显著增强包括超分辨显微镜、共聚焦显微镜、宽场荧光显微镜以及自发荧光显微镜在内的多种成像模式的性能。实验数据充分证明，POPE能够在从简单溶液样本到复杂厚组织的一系列生物应用中，有效改善图像的信噪比、空间分辨率和采集速度。

POPE技术拥有令人兴奋的发展前景。下一步的研究方向可能包括将其与多光子激发技术相结合，以更好地克服生物组织中的光散射问题，从而实现对更厚样本（如类器官、全胚胎等）的高质量深层成像。此外，通过移除非必需的光学滤片并优化光路，POPE系统有潜力演变为类似4Pi的干涉测量系统，从而在进一步提升光子收集效率的同时，实现轴向分辨率的纳米级锐化。随着技术的不断优化和普及，POPE有望成为生物医学研究实验室的一种标准配置，通过释放荧光成像的全部潜力，为生命科学研究和临床诊断提供更加强大的观察工具，最终推动我们在细胞和分子水平上对生命过程的理解。

DOI:10.1038/s44172-025-00491-6