多光子光声显微镜对脑细胞内源性辅酶NAD(P)H的高分辨率深度成像
2025-11-05 来源:本站 点击次数:57本论文的重要发现者为Tatsuya Osaki、W. David Lee、Xiang Zhang、Rebecca E. Zubajlo、Mercedes Balcells-Camps、Elazer R. Edelman、Brian W. Anthony、Mriganka Sur和Peter T. C. So，论文标题为“Multi-photon, label-free photoacoustic and optical imaging of NADH in brain cells”，于2025年发表在《Light: Science & Applications》期刊。
重要发现
01成像系统开发与原理
本研究核心是开发了一套新型无标记多光子光声显微镜系统（LF-MP-PAM），该系统整合了近红外飞秒激光（波长1300纳米）和声学传感器，实现了光学激发与声学检测的协同作用。系统采用三光子激发机制，针对NAD(P)H的低量子产率特性，通过热膨胀产生声波信号，再利用超声传感器捕获这些信号进行成像。与传统光学成像相比，声波在生物组织中散射较小，从而显著提升了穿透深度。系统关键组件包括非共线光学参量放大器（NOPA）、galvo-galvo扫描器和定制声学传感器，确保了单细胞级分辨率（横向约2.2微米，轴向约30微米）。通过K-Wave模拟，预测了声波频率在90-125兆赫兹范围内，与实际实验数据一致。
研究首先在凝胶组织模型中对NAD(P)H进行了系统验证。通过改变NADH浓度（从1毫摩尔到150毫摩尔），观察光声信号和荧光信号的变化，证实了信号与浓度之间的线性关系，且光声检测灵敏度高于光学方法，最低可检测至1毫摩尔浓度。激光功率实验显示光声信号与功率的三次方成正比，验证了三光子激发机制。频率分析通过小波变换揭示声波主频在60-90兆赫兹，与模拟结果吻合。
随后，在活细胞实验中，团队将HEK293T和HepG2细胞与NADH溶液孵育30分钟，利用光声显微镜监测细胞内NAD(P)H水平变化。结果显示，孵育后光声信号显著增强5倍，同时通过流式细胞术和荧光显微镜使用NAD(P)H传感器独立验证了NADH摄取增加，排除了其他色素（如FAD或胶原蛋白）的干扰，确认信号主要源自NAD(P)H。
03深度成像应用与脑组织研究在脑切片实验中，系统成功对野生型小鼠脑切片进行了内源性NAD(P)H的光学和光声测量。光学成像通过光电倍增管（PMT）捕获NADH荧光和三次谐波生成（THG）信号，实现了单神经元活动监测，显示NADH水平随神经元放电呈周期性变化，且不同脑区（如中脑比皮层）NADH浓度存在差异。光声检测则捕获到延迟2.6微秒的声波信号，信噪比达9.7:1，证实了在复杂组织中的可行性。
关键突破体现在深度成像能力上：在1毫米厚脑切片中，光声信号在700微米深度仍保持高信噪比，衰减曲线符合组织吸收散射模型；在人类iPS细胞衍生的脑类器官中，成像深度进一步达到1100微米，而光学信号在400微米深度即衰减至噪声水平。此外，类器官培养时间（从21天到90天）与NADH水平增加相关，凸显了该技术在监测组织发育中的应用潜力。
04实时成像系统集成团队进一步开发了实时成像子系统，通过集成高速数据采集板和ScanImage软件，实现了光声和光学信号的同步采集与处理。系统设置窄时间窗口（约2.6微秒延迟）进行像素平均，生成NAD(P)H空间分布图。在脑类器官和脑切片实验中，光声图像与THG图像高度一致，且经去噪处理后可分辨单细胞结构，验证了其在深层组织中的成像优势。
创新与亮点
01突破传统成像深度限制
本研究的核心创新在于解决了长期困扰生物成像领域的深度难题。传统全光学成像方法受限于组织对紫外荧光的强烈吸收，在脑组织中的有效深度仅为100-200微米，而光声成像通过声学检测避开了光学散射，将深度提升至700微米（脑切片）和1100微米（类器官），相当于传统方法的6倍以上。这种突破得益于多光子激发与声学传输的协同：近红外激光（1300纳米）减少了组织衰减，同时低量子产率的NAD(P)H在激发时产生大量热能，转化为可检测的声波。与磷磁共振波谱（P-MRS）等深度技术相比，本方法保持了单细胞分辨率，填补了深层组织无标记代谢成像的空白。
02新技术融合与多模态成像
LF-MP-PAM系统首次将三光子光声成像应用于NAD(P)H检测，实现了多模态集成。系统同时捕获光学（如荧光、THG）和光声信号，允许实时对比验证，增强了数据的可靠性。例如，在脑切片中，NADH光学信号与神经元钙活动动态相关，而光声信号则提供了深度信息。这种多模态能力不仅提升了成像的丰富度，还为研究代谢与电活动的关联提供了新途径。技术上，系统采用定制声学传感器和实时处理管道，确保了高帧率（如0.76帧/秒）和高灵敏度，为活体应用奠定了基础。
03在生物医学中的广泛应用价值
这项技术的光学生物医疗价值显著，尤其适用于神经科学和疾病模型研究。NAD(P)H作为代谢标志物，与神经元活动、癫痫、阿尔茨海默病等密切相关，本方法使得在深层组织中实时监测代谢变化成为可能。例如，在脑类器官中成功监测到发育相关的NADH增加，证明了其在模拟人类脑疾病中的潜力。未来，该技术可扩展至其他器官类器官（如肝、肾）或结合基因编码传感器（如GCaMP），用于个性化医疗和药物筛选。此外，无标记特性避免了荧光标记的侵入性，更贴近临床转化需求。
总结与展望
本研究通过开发LF-MP-PAM系统，成功实现了对NAD(P)H的无标记、深度成像，突破了传统光学成像的深度限制，为脑代谢研究提供了强大工具。实验验证从凝胶模型到活细胞、脑切片和类器官，系统性强，结论可靠。技术亮点在于多光子光声融合，实现了单细胞分辨率下的毫米级穿透，兼具高灵敏度和实时性。
展望未来，该系统有望推动神经科学领域的变革，例如在活体动物或人类大脑中监测神经元活动，或应用于疾病早期诊断。尽管当前系统仍需优化（如提升分辨率、实现同侧成像），但其潜力巨大，结合人工智能和临床设备，或将成为下一代生物成像技术的标杆。总之，这项工作不仅解决了成像难题，更开启了代谢动力学研究的新篇章。
论文信息声明：本文仅用作学术目的。
Osaki T, Lee WD, Zhang X, Zubajlo RE, Balcells-Camps M, Edelman ER, Anthony BW, Sur M, So PTC. Multi-photon, label-free photoacoustic and optical imaging of NADH in brain cells. Light Sci Appl. 2025 Aug 7;14(1):264.
DOI:10.1038/s41377-025-01895-x.