筛选步骤:
a.杀灭曲线的确定
1.将未转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板,孵育过夜,
2.第二天,除去24孔板中旧的培养基,
3.将含不同浓度嘌呤霉素(1ug/mL,2ug/mL,3ug/mL,4ug/mL,5 ug/mL,6ug/mL,7ug/mL)的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板,
4.每2天更换新鲜的筛选培养基,
5.每天观察细胞的存活比例,
6.最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度。
b.嘌呤霉素筛选转染细胞
1.第一天,将转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板,孵育过夜
2.第二天,除去24孔板中旧的培养基,
3.加入含嘌呤霉素(2ug/mL)的筛选培养基,孵育,
4.每2天更换新鲜的筛选培养基,
5.每天观察细胞的存活比例,
6.在同一时间点(2d)存活的细胞,即为转染成功细胞,
7.对筛选后的细胞进行扩增。