ELISAs遵循抗原与其特异性抗体结合的基本原理。这允许检测样品中的分析物，即使是少量存在。ELISAs可用于检测激素、肽、蛋白质和小分子，并可用于工业和研究中的医学诊断和分析物测量。已经开发了各种类型的ELISAs，对它们的基本步骤进行了一些改变。然而，它们都仍然使用基本原理，即抗体将与抗原上的特定表位结合。使用酶和底物(通常是TMB和HRP)来产生颜色变化，然后可以用于确定样品中存在的分析物的浓度。测量OD吸光度值并从已知的抗原浓度产生标准曲线允许计算分析物的浓度。

这些被认为是简单的ELISA形式。它们被称为直接的，因为检测过程只需要使用一种抗体。将样品涂覆到板上，随后封闭该板。初级检测抗体直接用缀合酶标记，当加入底物时，该酶产生颜色变化。不需要二抗。当测试样品中感兴趣的分析物时，还必须使用封闭剂如BSA来封闭任何其他潜在的结合位点。直接ELISAs被认为可以减少其他抗体之间的交叉反应，因为只使用一种抗体。然而，由于这些分析中使用的一级抗体需要用酶标记，这可能增加进行多重分析的成本和生产它们所需的时间。对于每个新的分析，需要标记新的检测抗体。直接ELISA被认为具有较低的灵敏度，因为与间接ELISA相比，分析产生的信号被放大得较少；然而，它们可以更快地进行，因为检测只需要一个步骤。

间接ELISAs需要使用两种抗体进行检测。这涉及一个两步过程，增加了进行检测所需的时间。首先将感兴趣的抗原涂在板上，然后将初级抗体引入孔中。如果孔中存在感兴趣的抗原，初级抗体将特异性结合该抗原。在此之后，将引入第二抗体，该第二抗体将预先用用于检测的酶标记。第二抗体将与抗体结合，抗体又与抗原结合。然后可以根据观察到的颜色变化来确定抗原的浓度。与抗原结合的抗体越多，颜色变化越大，因为在洗涤循环后去除的越少。这种方法的好处包括更高的灵敏度，因为不止一种标记抗体可以与初级抗体结合。还可以增加灵活性，因为一种以上的二级检测抗体可以与单个一级检测抗体一起使用。由于只需要标记一种类型的抗体，因此还可以降低进行该分析的成本。