肝细胞维持培养基（HMM）试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用     
【适用范围】
本试剂盒用于维持人原代肝细胞培养，可维持原代肝细胞（PHH）的形态和功能长达2个月。
【实验原理】
本试剂盒采用体外培养方法维持人原代肝细胞的形态和功能，由基础培养基和营养添加物等成分组成，含有特定生长因子和小分子，可有效抑制人原代肝细胞的衰老、凋亡和去分化，长期维持肝细胞的多角形及双核形态和结构，保持白蛋白和细胞色素氧化酶CYP家族等功能蛋白的表达水平和功能状态。在肝细胞维持培养基中培养人原代肝细胞的接种密度为2×10⁴-3×10⁴/cm²，可用于体外肝细胞毒性测试、HBV病毒感染以及肝病发生过程模拟等研究。
【试剂盒的组成】

试剂盒组成	规格	6孔板/月用量	保存条件	有效期
说明书	1份	/	/	/
基础培养基（HepX medium）	500ml	110 ml	2-8℃	1年
营养添加物（HepSup）	40.8ml	10 ml	-20℃	1年
包被液（HepCoat）	200μl	50 μl	-20℃	1年

【肝细胞维持培养基（HMM）配制】
120ml肝细胞维持培养基配制：110 ml HepX medium与10 ml HepSup混匀。
【包被液处理】
使用时将6孔板及枪头4℃预冷，将HepCoat从-20℃冰箱中取出，在4℃解冻，在冰上快速以1:80的比例与HepX medium混匀，然后包被六孔板，每孔包被0.8 ml，放置37℃，30分钟后取出后吸走多余混合液。
【使用方法】

• 生物安全柜中，将10ml肝细胞维持培养基加入到15ml离心管中，37℃恒温水浴锅预热10分钟。
• 将冻存原代肝细胞从液氮中迅速转移至37℃恒温水浴锅中，在水中顺时针旋转解冻约90-120秒，直至冻存管中只有小块碎冰漂浮。
• 利用钝枪头将细胞吸出，并以滴加方式转移至10ml预热的肝细胞维持培养基中，轻微上下颠倒2-3次混匀。
• 室温放置30-45分钟后（每15分钟轻轻颠倒混匀一次），再进行低速离心（50×g，常温离心5分钟），去上清，用5ml肝细胞维持培养基（HMM）重悬细胞，用台盼蓝染色法测定肝细胞的存活率和细胞总数。
• 按活细胞数2×10⁴-3×10⁴/cm²（优选3×10⁴/cm²）的密度接种到经包被的培养板中摇匀，在37℃，5%二氧化碳培养箱中培养6-8小时后，观察细胞的贴壁状态，换液；之后每2天换液一次。

【结果检测】

• 原代肝细胞形态学

用肝细胞维持培养基（HMM）进行原代肝细胞的培养，分别在细胞培养的第0，3，7，14，21，24，28，35，42，49，56天镜下观察细胞形态并拍照。

• 原代肝细胞功能

分别于细胞培养的第0，3，7，14，21，24，28，35，42，49，56天留取培养细胞的上清，分别用ELISA方法检测细胞ALB，AAT分泌水平，尿素检测试剂盒检测细胞尿素合成能力以及氨清除试剂盒检测肝细胞解毒能力。
【结果判定】

• 通过形态学观察，经过56天培养，肝细胞能维持多角形形态，基本与原代肝细胞形态一致。
• 通过ELISA方法检测，肝细胞扩增培养基可以在56天内有效维持肝细胞对ALB和AAT的分泌能力，同时，尿素合成和氨清除能力与原代肝细胞维持在同一水平。

【注意事项】
          实验操作应严格按照说明书进行。         
          肝细胞维持培养基2~8℃避光保存。