细胞活性分析

与增殖测定

小编前阵子去学了CPR，第一个步骤就是要先确认倒在那里的人是不是还…活着。
先生先生，你怎么了？（拍拍肩膀）
让小编开始好奇，我的细胞“要怎么判断他们是死是活呢？它们活的好吗?”

我们可以简单将分析细胞活力和增殖测定的方法分成5大类：

1. DNA合成增殖试验

2. 代谢增殖测定

3. 化学发光细胞活性测定

4. 荧光染料增殖试验

5. 台盼蓝细胞计数

以下简单介绍这些分类的几种常见实验方式吧！

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 DNA合成增殖试验 

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 BrdU检测法 

BrdU结构长的跟胸腺嘧啶核苷（Thymine）很像，当细胞生长通过增殖周期-S期（DNA半保留复制期）时，BrdU可鱼目混珠进入新合成的DNA中，因此在加入BrdU后分裂增殖的细胞都会带有含BrdU的DNA，可通过抗BrdU单克隆抗体检测，统计S期细胞百分数并计算细胞倍增时间；但BrdU单克隆抗体太大，无法直接与DNA双股螺旋上的BrdU结合（胖子上不了螺旋楼梯），所以实验过程需要将DNA部份变性，使双股部份解开成单股才能顺利检测，实验步骤较繁琐复杂。

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 EdU 检测法 

EdU原理跟BrdU检测法很像，都是代替胸腺嘧啶渗入正在复制的DNA中；但能与EdU共轭反应的染料分子仅为BrdU抗体的1/500,在细胞内更容易扩散，所以不需要变性处理，有效缩减实验操作时间，更能避免样品损伤，反应更真实的细胞增殖状况。

侦测方法：ICC、IHC、FACS、ELISA

02

 代谢增殖测定 

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 MTT检测法 

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶,能使额外添加的MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶,并沉积在细胞中，死细胞则无现象；再利用二甲基亚砜（DMSO）溶解MTT蓝紫色结晶（Formazan），即可利用酶标仪测定光吸收值，并计算出活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT蓝紫色结晶形成的量与细胞数成正比。

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 XTT检测法 

与MTT原理相似，皆是利用添加物与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶反应，并利用酶标仪测定产物光吸收值；不同于MTT法的是，XTT反应产物为水溶性橙黄色物，不需经过二甲基亚砜（DMSO）溶解步骤，即可直接测定光吸收值，操作较MTT方便快速。

03

 化学发光细胞活性测定 

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 ATP发光法 

原理是利用外源的萤火虫荧光素（Luciferin）与荧光素酶（Luciferase），以细胞内含的ATP为能量来源，发生氧化反应产生生物冷光；而ATP是活细胞的必含物质，在细胞内含量恒定，因此可通过监测冷光光度，来对应ATP含量并判断细胞增殖状况。

04

 荧光染料增殖试验 

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 CFSE检测法 

CFSE是一种可穿透细胞膜的荧光染料，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；当CFSE扩散穿过细胞膜，会与细胞内酯酶产生水解反应而发出绿色荧光，这些带荧光的CFSE会进一步与细胞骨架蛋白结合，形成稳定的胞内荧光蛋白。每当细胞进行分裂增殖，胞内荧光蛋白会被平均分配到下一代细胞中，因此细胞荧光强度会随着增殖代数增加而不断的降低，可用流式细胞仪进一步侦测分析得出细胞分裂增殖的情况。

05

 台盼蓝细胞计数 

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 台盼蓝（Trypan Blue）计数法 

台盼蓝是一种蓝色染料，无法通过结构完整的细胞膜进入细胞内部；但细胞死后，丧失细胞膜稳定性，台盼蓝会进入细胞将细胞染成蓝色，因此在细胞实验中，被常规的搭配自动细胞计数仪或血球计数板应用于区分活细胞和死细胞。