免疫检查点阻断（ICB）治疗的应用，在多种肿瘤治疗中取得良好疗效，极大的改变了肿瘤治疗策略。然而在临床试验中，依然有部分患者无法从中获益，例如基因组微卫星稳定（MSS）的结直肠癌（CRC）病人。除了靶向T细胞的免疫治疗外，靶向髓系免疫细胞，如肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和树突状细胞（DC）的多项治疗策略也已进入临床前试验阶段。
 
单细胞转录组测序（scRNA-seq）是确定肿瘤中细胞多样性的有力工具，但其在解析免疫治疗机制方面的应用却很少。肿瘤细胞异质性导致的生物学功能、不同髓系细胞亚群之间的关系以及靶向髓系细胞的免疫治疗的不同应答都尚不清楚。
 
一篇题为“Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer”的研究于2020年发表在Cell上，研究利用scRNA-seq绘制了结肠癌患者的肿瘤、邻近正常组织以及血液中的免疫细胞高分辨率图谱，构建了细胞之间的互作网络以确定参与调节肿瘤发生发展以及抗肿瘤免疫性的关键细胞群体，并探讨了目前正在进行临床测试的骨髓靶向免疫疗法的潜在机制。
 
实验设计
研究者结合液滴法（10x Genomics）及平板法（SMART-seq2）两种scRNA-seq技术，对18例结直肠癌患者的肿瘤组织、癌旁正常组织及外周血中的CD45+免疫细胞及CD45-基质细胞进行了单细胞转录组测序，刻画了高分辨率的结直肠癌免疫图谱。  
 
 
单细胞测序技术的主要应用结果
1. 鉴定人类CRC的瘤内细胞类型
研究者采用两种单细胞测序技术，对18例结直肠癌患者的肿瘤组织、癌旁正常组织及外周血进行了单细胞转录组测序，共获得了43,817个（10x scRNA-seq）和10,468个（Smart-seq2）单细胞的转录本。比较两种技术，前者细胞数量大，可有效的获得更多细胞亚群；而后者能够捕获更多的基因，可深入分析调控信号通路。根据这些转录本数据，研究人员刻画了高分辨率的结直肠癌免疫图谱（图2），包括13个髓系细胞亚群、4个ILC细胞亚群、18个T细胞亚群和5个B细胞亚群。  
 
2. CRC浸润髓系细胞亚群的组织特异性模式
研究人员对13种髓系细胞亚群的基因特征进行分析，将其注释为以下亚群（图3A-C）：一个肥大细胞亚群（hM01）；三个树突状细胞（DC）亚群（hM02-hM04），包括浆细胞样树突状细胞（pDC）、cDC2和cDC1细胞；三个血液中富集的单核细胞亚群（hM05-hM07）；其他亚群被鉴定为巨噬细胞，分为组织驻留巨噬细胞（RTMs）（hM08-hM10）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）（hM12-hM13）。
 
在所有RTM亚群中，均观察到促炎细胞因子基因IL1B的表达，其中hM08亚群中的表达量最高，hM09特异性表达LYVE1和IL10，可能在抑制炎症和纤维化方面起到重要作用（图3D）。进一步，通过RNA速率分析，研究人员发现从表达CD14的单核细胞向FCN1+单核类似细胞（hM11）和不同巨噬细胞亚群之间具有明显的定向流动，提示了巨噬细胞的发育轨迹（图3E-F）。  
 
3. CRC中TAMs的功能及细胞互作
根据以上的细胞聚类和巨噬细胞的发育轨迹分析，研究人员将TAMs分为具有不同发育轨迹和不同功能的C1QC+ TAM（hM12）和SPP1+ TAM（hM13）两个细胞亚群。前者可能通过hM10发育而来，具有细胞吞噬和抗原呈递的功能，后者可能由hM08发育而来，具有促血管生成及促进肿瘤转移的功能（图4A-D）。
 
基于scRNA-seq和TCGA数据，预测构建了CRC肿瘤中的细胞亚群互作网络，TAMs和cDC作为互作网络的核心，与其他细胞亚群的关联最多。其中SPP1+ TAM主要与肿瘤相关纤维母细胞（CAFs）和成纤维细胞发生相互作用；而C1QC+ TAM主要与两种cDC和多种T细胞亚群细胞互作，在调节抗肿瘤T细胞应答中起作用（图4E）。进一步，配体-受体互作得分分析也确认了C1QC+ TAM在招募或激活T细胞中具有潜在作用，SPP1+ TAM与肿瘤生长和转移有关（图4F）。
 
随后，研究人员整合了肿瘤相关的小鼠髓系细胞亚群与人类的髓系细胞亚群，确定了15个离散细胞簇，并发现在人类结直肠癌患者和小鼠肿瘤模型之间存在功能相似的TAM细胞亚群（图G-H）。  
 
4. 促进血管生成的巨噬细胞亚群对anti-CSF1R治疗具有耐受性
接下来，研究人员利用小鼠肿瘤模型来研究靶向不同髓系细胞的免疫治疗对抗肿瘤免疫反应造成的影响。在小鼠模型中进行anti-CSF1R治疗后，分析了小鼠肿瘤浸润免疫细胞的单细胞转录组图谱。相较于对照抗体治疗，anti-CSF1R治疗的小鼠减少了TAMs的频率，C1QC+ TAM特征的巨噬细胞亚群（mM12和mM14）几乎完全消失，而SPP1+ TAM特征的巨噬细胞减少很少（mM11、mM13和mM15）（图5A-D）。Anti-CSF1R治疗可以影响处在细胞周期中的巨噬细胞的增殖，不同巨噬细胞亚群对anti-CSF1R治疗的敏感性不同（图5F-H）。
 
为挖掘以上结果与人类的关联性，研究人员比较了人类结直肠癌患者的生存率，发现低C1QC+ TAM和高SPP1+ TAM的组合与较差的预后相关（图5I）。综上所述，anti-CSF1R治疗可能不足以耗尽所有具有促进肿瘤生长潜力的巨噬细胞亚群，这可能是其在小鼠肿瘤模型和人类癌症患者中单药治疗效果不佳的原因。  
 
5. Anti-CD40治疗导致cDC1群体的早期特异性扩增
 
研究人员对小鼠模型进行了anti-CD40治疗，观察到小鼠肿瘤生长的减少，这一现象在结合PD1阻断治疗时得到了进一步的增强（图6A-B）。在包括cDC1在内的多个髓系细胞和T细胞亚群中存在CD40的表达，且cDC与多种T细胞亚群之间存在广泛互作（图6C-E）。治疗后不同时间点的scRNA-seq数据的分析显示，anti-CD40治疗早期激活的主要髓系细胞是Ccl22+ cDC1细胞，这些被激活的Ccl22+ cDC1细胞表达CD80、CD86以及IL-12，活化cDC1s的标记基因与CRC患者的良好预后存活率呈正相关，提示anti-CD40治疗激活的这些细胞功能可能与人类癌症有关（图6F-J）。  
 
6. Anti-CD40治疗增加效应记忆CD8+ T细胞并诱导肿瘤中Bhlhe40+ Th1类似细胞的活化和扩增
 
为探索anti-CD40治疗影响肿瘤浸润性T细胞功能的具体机制，研究人员对治疗后小鼠模型中的T细胞进行了scRNA-seq分析，发现Anti-CD40治疗显著增加了肿瘤记忆CD8+ T细胞亚群的比例，并降低了耗尽CD8+ T细胞的数量（图7）。
 
同时，研究人员还发现anti-CD40治疗对肿瘤浸润的CD4+ T细胞亚群也有显著影响，在治疗的第2天促进了调节性T细胞（regulatory T cell; Treg）的扩张，但在第10天抑制了Treg的扩张；而在anti-CD40治疗后的第2天和第10天都特异性地诱导了Bhlhe40+ Th1类似细胞的克隆增殖，以及Bhlhe40+ Th1类似细胞中Cd40lg的表达，增强了其与cDC1细胞之间的相互作用（图8）。  
   
主要结论
1. scRNA-seq的数据提示TAMs和cDCs包含细胞与细胞相互作用网络的中心，TAMs通过与CRC免疫微环境中不同的免疫细胞和基质细胞相互作用发挥两种不同的功能。
 
2. 两种不同的TAMs亚群分别具有细胞吞噬、抗原呈递以及促血管生成、促进肿瘤转移的功能。
 
3. Anti-CSF1R治疗会特异性消除具有炎症特性的巨噬细胞，但对表达促进血管生成、肿瘤发展相关基因的巨噬细胞影响不大。
 
4. Anti-CD40治疗可以偏好性激活cDC亚群，诱导Bhlhe40+ Th1类似细胞和CD8+记忆T细胞的增殖。
   
总结
研究通过单细胞转录组技术探索了结直肠癌患者的肿瘤微环境，对其中的浸润髓系细胞进行了系统性的刻画，分析了肿瘤相关巨噬细胞的亚群特征、谱系发育情况。并进一步鉴定了在肿瘤微环境中的细胞互作中发挥关键作用的特定髓系细胞亚群。在此基础上，研究通过对小鼠模型的单细胞测序数据分析，揭示了髓系细胞靶向治疗anti-CSF1R和anti-CD40对肿瘤浸润的免疫细胞亚群在细胞组成、细胞功能、细胞互作等方面的影响。
 
研究结合肿瘤患者及小鼠模型的单细胞转录组来研究肿瘤免疫治疗，揭示了靶向髓系细胞免疫治疗的潜在机制，为相关免疫治疗提供了更明确的指导；并为人们研究肿瘤及其他疾病中的免疫细胞，以及开发新的临床检测与治疗方案提供了新的思路。
 
参考文献
Zhang, L., Li, Z., Skrzypczynska, K. M., et al. (2020). Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer. Cell, 181:442–459.e29.