电穿孔是用于转移非病毒载体以及将其他分子（DNA、药物、RNA 或蛋白质）引入靶细胞的技术之一。这种方法通过对细胞施加短持续时间和高电压的电场，当电脉冲超过膜电容时，其稳定性会受到影响并形成瞬时的可逆孔隙，分子可以通过这些孔隙进入细胞。利用电穿孔技术进行对细胞或活体的电转染是一种现今常用的将DNA、siRNA 等分子输送到细胞中的简单有效的方法。利用电穿孔进行的转染对比其他方法，不仅操作简单快速、无需添加专用试剂、适用性广，而且其转染率高、无需考虑安全因素，在瞬时完成转染过程的同时达到稳定转染的目的。

每种细胞类型需要的电转条件略有不同，需要更优的转染效果必须通过实验确定电转条件。有的细胞如原代细胞、免疫细胞、干细胞等会出现较难转染的情况。而对于难转染悬浮细胞，电穿孔是唯一成功用于将各种分子高效转移到非贴壁细胞系中的技术。由于大多数转染方法对非贴壁细胞难以进行，所以对靶基因的电转成为将目的基因引入悬浮细胞的常见策略。在电转难转染细胞前，通过预实验快速有效的优化电转条件，可以高效且一致地将核酸递送到细胞中，同时保持细胞活力。

《Systemic Optimization of Gene Electrotransfer Protocol Using Hard-to-Transfect UT-7 Cell Line as a Model》是立陶宛健康科学大学肿瘤研究所肿瘤研究实验室在2022年11月发表于Biomedicines的文章。该实验以UT-7这种转染效率很低的悬浮细胞为例，讨论对于难转染的细胞系进行电转染实验方案的条件优化，以平衡尽可能高的转染效率与电转后的细胞活力和细胞生长状态。其中关于电转染过程的系统优化可以为我们在电转染实验中探索难转染细胞的转染条件提供参考方法与改进方向。

实验对UT-7 细胞系进行质粒的电转，将编码绿色荧光蛋白的质粒pEGFP用作评估转染效率的指标。通过进行不同的电穿孔参数的多组实验，包括电脉冲方案的配置（振幅、持续时间、电压和脉冲数）、DNase抑制剂、DNA/RNA浓度等，系统分析实验结果，以实现高转染率且高细胞活性的电转移。

在不同脉冲强度和持续时间条件下 pEGFP 基因电转后 UT-7 细胞的活力，通过流式细胞术计数、MTS 测定和 PI 染色进行评估。

实验建立了一种门控策略，用于正确评估与 PI 共染色的转染细胞，以区分样品中四种不同的细胞亚群：转染/活 (pEGFP+/PI-)、 未转染/活 (pEGFP-/PI-)、 转染/死亡 (pEGFP + /PI+) 和未转染/死亡 (pEGFP-/PI+)。门控策略首先通过根据前向散射面积 (FSC-A) 与前向散射高度 (FSC-H) 的光学特性绘制细胞的流式散点图，如图1A。然后从未转染的细胞(GFP-)中分离转染细胞 (GFP+)，如图1B。从死细胞 (PI+)中分离活细胞 (PI-)，如图1C。由于无补偿情况下GFP荧光会溢出到PI通道，如图1E。所以在GFP通道中使用了6%的补偿，如图1F。

通过流式细胞术计数、MTS 测定和 PI 染色以区分活细胞和死细胞，从而对转染后的细胞活率进行评估，利用三种不同的测定法来确定 UT-7 细胞的活力。因为无法在不丢失活细胞的情况下从样品中洗掉死悬浮细胞，所以使用碘化丙啶 (PI) 来染色，然后通过流式细胞术对样品中的所有细胞进行计数来获得总细胞数，并将 PI 阳性（死）细胞排除在外。同时实验尝试了不同的电转参数，并将PI染色 结果、MTS 测定结果与总细胞数进行了比较，如图2。

根据图2统计结果，细胞死亡率随着电脉冲电压和持续时间的增加而增加。代表细胞代谢活动的 MTS 结果仅在 1.4 kV/cm 250 µs 至 1.4 kV/cm 500 µs 不包括 1.2 kV/cm 500 µs 的电转后明显更高。且与 PI 阴性（活细胞）量相比，仅在1.4 kV/cm 500 µs使用 MTS 测定法确定的细胞活力显着更高。根据统计结果可见PI 染色和代谢活动显示出相似的结果，相比而言使用 PI 染色可以同时测量细胞活力和转染效率，所以对于本实验PI 方法被优于 MTS 方法，在本实验中以PI染色结果作为细胞活性的判断标准。

根据转染效率与细胞活率，通过实验数据分析不同脉冲强度和持续时间对转染结果的影响趋势。实验测试了不同的电穿孔条件，包括电场强度（1.2、1.4、1.6、1.8 kV/cm）和脉冲持续时间（100、250、500、750 μs）的变化。在每个实验中，施加单个高压脉冲，并使用 20 μg/mL 的质粒，转染结果如图3。每组条件转染后的 UT-7 细胞可分为四个亚群，转染/活细胞(GFP + /Viable)、转染/死细胞 (GFP + /Dead)、未转染/活细胞 (GFP- /Viable) 和未转染/死为 (GFP- /Dead)，它们的总数为样本中的总细胞数，如图3A。转染/活细胞亚群中的pEGFP平均荧光强度如图3B。

图3A的数据表明，增加脉冲强度和持续时间是转染/死亡细胞数量增加的重要原因，由于一些细胞被成功转染并且可以产生足够被检测到的EGFP蛋白但已经死亡。此外，增加脉冲持续时间与转染/活细胞比例增加直接相关。相比之下，脉冲强度对转染/活细胞比例的作用不那么明显。同时，死细胞亚群的细胞数量也是随脉冲持续时间而非脉冲强度增加。对于未转染/存活的亚群细胞数量和总细胞数量而言，都是随着脉冲强度和持续时间的增加而显着减少。该数据表现了了电转参数选择的复杂性。

与此同时，通过图3B可知，转染/活细胞亚群中平均荧光强度比转染/活细胞数的增加更明显，结果表明增加脉冲强度和持续时间有助于更多质粒分子进入细胞。

使用DNase抑制剂ZnSO4，在之前证明转染效率最高的实验条件下评估ZnSO4对转染效率GET的影响。用 1.4 kV/cm 250 µs、1.6 kV/cm 250 µs、1.8 kV/cm 250 µs、1.2 kV/cm 500 µs、1.4 kV/cm 500 µs 和 1.2 kV/cm 750 对UT-7 细胞进行电穿孔，之后分别加入80 µM和100 µM ZnSO4孵育48小时后分析转染结果，如图4。每组条件转染后的 UT-7 细胞可分为四个亚群，转染/活细胞(GFP + /Viable)、转染/死细胞 (GFP + /Dead)、未转染/活细胞 (GFP- /Viable) 和未转染/死为 (GFP- /Dead)，它们的总数为样本中的总细胞数，如图4A。转染/活细胞亚群中的pEGFP平均荧光强度如图4B。

ZnSO4充当细胞内核酸酶的抑制剂，可以在质粒 DNA 进入细胞后防止质粒降解。然而，通过数据可知ZnSO4对UT-7 细胞的 pEGFP 转染效率没有作用。如图 4A所示，同一的电转参数和不同的ZnSO4浓度，转染/活细胞的亚群数量保持不变。且如图 4B所示，对于不同的ZnSO4浓度时，平均荧光强度没有显著变化。通过实验数据分析得知，DNase抑制剂ZnSO4并未对转染产生影响。

为探索在电转溶液中质粒pEGFP浓度对 UT-7 细胞转染效率的影响，测试了多种质粒浓度，包括20µg/mL、50µg/mL、100µg/mL 和 200 µg/mL。使用电压强度为1.2kV/cm和1.4kV/cm，持续时间为 250 µs 的单个高压脉冲。根据转染效率与细胞活率，通过实验数据分析不同质粒浓度对转染效率与细胞活性的影响趋势。转染结果如图5。每组条件转染后的 UT-7 细胞可分为四个亚群，转染/活细胞(GFP + /Viable)、转染/死细胞 (GFP + /Dead)、未转染/活细胞 (GFP- /Viable) 和未转染/死为 (GFP- /Dead)，它们的总数为样本中的总细胞数，如图5A。转染/活细胞亚群中的pEGFP平均荧光强度如图5B。

根据统计学分析可知pEGFP 质粒浓度是提高 UT-7 细胞转染效率的关键因素。结果表明，将 pEGFP 质粒从 20 µM 增加到 200 µM 对细胞活力的影响很小，因此较高浓度质粒的使用可以获得更多转染/存活的细胞。

本实验对电转pEGFP 质粒 DNA 到悬浮 UT-7 细胞系的方案进行了优化。结果发现，UT-7 细胞的转染细胞率和细胞活力依赖于所选的方波脉冲持续时间，并且关键依赖于使用的质粒 DNA 浓度，如图6所示。

实验分析可知，提高基因电转到UT-7 细胞中效率的是电脉冲持续时间而不是电压强度。但是脉冲强度和持续时间的增加大大降低了细胞活力，且转染/活细胞数量没有显着增加。另一方面，质粒浓度的增加大大提高了转染效率，对细胞活力影响轻微。

在本次电转优化过程中可以得到结论：1、与脉冲强度相比，高压脉冲持续时间的增加可以更有效的将基因电转到UT-7 细胞中；2、一味地增加高压脉冲强度和持续时间会导致更高的细胞伤害，而转染/活细胞数量并不会增加；3、与脉冲持续时间和强度相比，pDNA 浓度的增加对转染/活细胞亚群增加的影响更为显着；4、DNAase 抑制剂 ZnSO4 对 pDNA 电转到UT-7 细胞没有影响，也不影响细胞活力。

1.对于难转染的细胞，进行不同电转参数下电转结果的测定方法与统计方法，有利于对电转细胞条件的讨论，推荐使用pDNA荧光与PI结果分析细胞活率和转染效率。可多组进行预实验，对电转条件进行优化。对于难转染细胞不推荐使用程序型的电转染或核转染设备，由于其具体电脉冲参数用户无法得知且不允许用户控制电转染参数，客户无法根据需要对电穿孔过程的具体参数进行调整达到最优电转效果。

2.对于难转细胞优化电转效率的方向，首先考虑提高质粒的浓度，其次考虑适当增加高压脉冲的持续时间和电压强度，根据细胞转染实际情况调整电转条件。

参考文献

[1] Vadeikienė R, Jakštys B, Ugenskienė R, Šatkauskas S, Juozaitytė E. Systemic Optimization of Gene Electrotransfer Protocol Using Hard-to-Transfect UT-7 Cell Line as a Model. Biomedicines. 2022 Oct 24;10(11):2687. doi: 10.3390/biomedicines10112687. PMID: 36359207; PMCID: PMC9687892.

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