文献信息
同济大学医学院施剑林院士团队及其附属上海市第十人民医院骨科等团队的研究成果Hydrolysis of 2D Nanosheets Reverses Rheumatoid Arthritis Through Anti-Inflammation and Osteogenesis (2D纳米片原位水解通过抗炎和成骨治疗类风湿性关节炎) 在学术期刊《ADVANCED MATERIALS》 (IF：27.4) 上发表。平生公司的离活一体CT (NEMO) 在论文中提供了重要的小鼠踝关节、兔子膝关节图像和定量分析结果。

该论文的通讯作者为同济大学医学院霍敏锋研究员和吴鹏副教授，第一作者为同济大学医学院冀鹏豪博士生。

文献摘要
类风湿性关节炎(RA)是一种关节功能障碍的炎症疾病。临床上，针对RA的药物仅侧重于减轻局灶性炎症，而不考虑骨微环境的促成骨重建。在本研究中，通过简单的液相剥离制备了二维层状二硅化钙纳米片(CSNs)。CSNs的水解产生抗氧化H₂、碱性Ca(OH)₂和二氧化硅。这些部分在抗氧化、抗炎和促骨生成中起着重要作用，导致比单独抗炎更好的RA治疗效果。氢气被证实可以消除过量的羟基自由基并调节巨噬细胞的再极化；生成的Ca(OH)₂可以中和酸性微环境并抑制破骨细胞活性；而且，溶解的Ca²⁺可以有效地与磷酸盐复合，矿化成Ca₃(PO₄)₂，促进病灶关节的成骨。

实验方法
佐剂诱导的关节炎（AIA）小鼠和兔模型
20只雌性Balb/c小鼠（6周龄）随机分为四组（N=5）。第一组被选为对照组，不进行任何治疗。另一组在小鼠右后踝关节注射25μL CFA，建立AIA模型。同时，左后踝关节注射相同体积的PBS。每三天用游标卡尺记录踝关节的宽度。计算右关节与左关节的宽度比，以评估关节肿胀程度。

 为了建立AIA兔模型，将20只兔子随机分为四组（N=5）。第一组被选为对照组，不进行任何治疗。其他组通过反复注射卵清蛋白（OVA）和CFA进行免疫接种。简而言之，将OVA溶解在PBS（20 mg mL^-1）中，并与等体积的CFA混合。然后在4°C下将混合物完全乳化。每周在背部皮下的五个部位注射1mL乳液对兔子进行免疫接种，持续3周。在第三周和第四周，将混合的OVA/CFA乳液注射到双侧膝关节中（每膝0.5mL），以诱导AIA兔模型。
 AIA小鼠关节炎治疗的体内评估：三组AIA小鼠（N=5）分别关节内注射25μL PBS或等体积含CSNs（3 mg kg⁻¹）或DMP（10 mg kg⁻¹）的PBS。每3天测量一次体重和踝关节宽度。评估3周后，处死所有小鼠并收集踝关节组织。通过RT-PCR分析评估促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）和抗炎细胞因子（CD206和IL-10）的水平，并通过显微CT（平生医疗科技有限公司）扫描评估组织形态计量学。还量化了关节的组织形态计量学参数（Tb.Sp和Tb.BMD）。
 

AIA兔关节炎治疗的体内评估：三组AIA兔（N=5）分别关节内注射500μL PBS或等体积含CSNs（3mg kg⁻¹）或DMP（10mg kg^−L）的PBS。每三天测量一次体重和踝关节宽度。1周内两次给药后，通过MRI记录膝关节的病理过程。评估期结束后，处死关节炎兔和正常兔，收集膝关节组织。通过ELISA评估促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）和抗炎细胞因子（IL-10）的蛋白质水平。通过显微CT（平生医疗科技有限公司）扫描评估组织形态计量学，并量化关节的组织形态计量参数（Tb、Sp和Tb、BMD）。

实验结果
采用佐剂诱导性关节炎（AIA）方法建立RA小鼠模型。具体来说，雌性Balb/c小鼠在右后踝关节内注射完全弗氏佐剂（CFA），然后免疫5天，导致关节明显肿胀（图6a；）。将15只关节炎小鼠随机分为三组（N=5），关节内注射PBS或等体积的含CSN或地塞米松磷酸钠（DMP，临床批准的药物）的PBS。另取5只未注射佐剂的健康小鼠作为对照组。DMP治疗组的小鼠体重略有下降，而其他组的小鼠在评估期的27天内体重没有明显波动，这可能是由于DMP的副作用造成的（图6c）。在对照组和DMP治疗组的小鼠中观察到可忽略或中等的治疗效果。CSNs组踝关节肿胀明显减轻（图6b）。在治疗终点拍摄的照片清楚地显示，与对照组和DMP组相比，CSNs组的踝关节肿胀明显减轻，与联合测量结果一致（图6d）。显微CT扫描图像显示，与正常组相比，关节炎组小鼠的踝关节有明显的骨侵蚀。CSNs和DMP均显著改善了骨侵蚀，验证了CSNs的高疗效（图6e）。基于显微CT分析的骨微观结构的组织形态计量学参数，如小梁骨矿物质密度（Tb.BMD）和小梁间距（Tb.Sp），表明CSN治疗后RA关节的骨显微结构与健康关节相似，这归因于CSN的强大抗炎和促生物矿化作用（图6f，g）。

图6. CSNs对AIA小鼠抗RA疗效的评价。a） 小鼠AIA模型建立和治疗方案的示意图。b） c）受不同治疗的小鼠的体重曲线。数据表示为平均值±标准差（N=5）。d） 不同组别小鼠踝关节的代表性照片。e） 在第27天，来自不同组的小鼠右踝关节的代表性3D重建显微CT图像。第27天不同组小鼠右踝关节骨微观结构的组织形态学显微CT分析[f）Tb.BMD和g）Tb.Sp]。数据表示为平均值±标准差（N=4）。h） mRNA（IL-6、IL-10、TNF-α、TNF-α）的相对表达，CD206）。数据表示为平均值±标准差（N=4）。i） 不同组别小鼠右踝关节的代表性H&E染色、赛峰红固定绿染色、ALP和TRAP染色图像。

显微CT分析的结果提供了股骨胫骨软骨下骨结构的信息（图7e）。从不同角度（如冠状面、正中矢状面和横断面）对膝关节进行计算重建，清楚地表明RA组兔子的股骨胫骨软骨下骨受到侵蚀。CSN治疗通过抗炎和释放生物矿化物质（无定形磷酸钙和二氧化硅）逆转了兔子的RA进展。DMP对家兔的抗炎治疗和RA逆转作用效果有限。股骨胫骨软骨下骨微观结构的组织形态计量学参数，如Tb.BMD和Tb.Sp用于定量分析RA关节的骨微观结构（图7f，g）。与显微CT重建图像一致，由于CSN具有强大的抗炎和探针矿化作用，CSN治疗后的骨参数与健康关节的骨参数相似。

图7.CSNs对AIA兔抗RA疗效的评价。a）兔AIA模型建立和治疗方案示意图。b）不同组别家兔膝关节周长的时间依赖性。数据表示为平均值±标准差（N=5）。c） 红外热成像图像和d）不同组别兔子膝关节的焦点温度。数据表示为平均值±标准差（N=5）。e）在第70天，不同组别兔子膝关节的代表性3D重建显微CT图像。不同组别兔膝关节骨微观结构的组织形态计量显微CT分析[f）Tb.BMD和g）Tb.Sp]。数据表示为平均值±标准差（N=3）。h）TNF-α，i） IL-6和j）在第70天从不同组的兔关节获得的滑液的IL-10。数据表示为平均值±标准差（N=3）。

使用结论
总之，通过简单的液相剥离方法成功合成了2D纳米片CSN，通过其水解产物——抗氧化/抗炎H₂气体和碱性Ca(OH)₂治疗类风湿性关节炎，这些产物抑制破骨细胞活性，并通过CSN中的Ca²⁺溶解促进CAP矿化实现促成骨作用。制备的CSN尺寸为280nm，RA的酸性微环境会加速水解反应，水解产生的Ca²⁺原位矿化成CAP促进骨修复。CSNs的抗氧化、抗炎、促成骨和抗破骨的作用在体外得到验证。从机制上讲，病灶的巨噬细胞的复极化在CSNs治疗RA中起着关键作用，这是通过纳米材料产生的氢气消耗过量ROS和恢复炎症稳态来实现的，机制上来说，主要是抑制NF-κB和MAPK信号通路的过度激活来实现。在AIA小鼠和兔模型中，合成的CSNs在抗炎和骨矿化方面表现出优异的生物安全性和治疗性能。作者的工作开发了一种精细的层状CSNs纳米药物，不仅可以抑制炎症，而且具备骨修复和软骨恢复功能，为对抗类风湿性关节炎提供了基本的理解和可转化的策略。

使用设备

                                  Micro CT (型号：NEMO) (平生医疗科技)

                                          影像软件：Avatar（平生医疗科技）