磁珠在核酸纯化中的实验步骤解析
2025-03-21 来源:本站 点击次数:380
磁珠进行核酸纯化的工作原理基于磁场分离技术和特异性吸附机制，通过磁珠与核酸分子的相互作用实现高效分离与纯化。
一、磁珠结构与功能
二、核酸提取纯化步骤
三、关键影响因素
四、技术优势与注意事项
五、应用场景
- 核心结构
磁珠由磁性内核（如Fe₃O₄、Fe₂O₃）、中间层高分子基质（如聚苯乙烯、二氧化硅）和功能化表面基团（如羧基、羟基、Oligo(dT)）组成。- 磁性内核：提供超顺磁性，使磁珠在外加磁场中快速聚集或分离。
- 功能基团：决定磁珠的吸附特异性（如羧基用于DNA吸附，Oligo(dT)用于mRNA捕获）。
- 表面修饰技术
通过硅烷化、共价偶联等方法修饰基团，增强核酸结合能力。例如：- 羧基磁珠：在高盐（如NaCl）和PEG条件下，通过离子桥（DNA-盐离子-羧基）吸附DNA。
- 硅羟基磁珠：依赖胍盐（如GuHCl）破坏核酸水化层，通过氢键和范德华力结合。
- 裂解
使用裂解液（含蛋白酶K、SDS等）破坏细胞膜，释放核酸。例如：- 动物组织需液氮研磨或蛋白酶K处理。
- 血液样本通过红细胞裂解液去除红细胞。
- 结合
磁珠与核酸特异性结合：- 静电作用：高盐环境屏蔽核酸负电荷，促进与带正电荷的磁珠表面结合。
- 疏水作用：PEG诱导核酸分子蜷缩，增强与磁珠的疏水相互作用。
- 氢键：核酸磷酸骨架与磁珠表面基团形成氢键。
- 洗涤
通过磁场（如达远辰光磁力架提供的稳定磁场）分离磁珠后，用洗涤液（如75%乙醇）去除蛋白质、多糖等杂质。需注意：- 高盐洗涤液（如TE缓冲液）用于去除污染物，低盐洗脱液（如ddH₂O）用于释放核酸。
- 乙醇漂洗需现配现用，避免残留影响后续实验。
- 洗脱
调整条件（如降低盐浓度、升高pH）破坏核酸与磁珠的结合，回收纯化核酸。例如：- 羧基磁珠在TE缓冲液中洗脱DNA。
- 硅羟基磁珠需用异丙醇或乙醇沉淀后溶解。
- 盐浓度
- 高盐（>0.5M NaCl）促进核酸与磁珠结合，低盐（<0.1M）用于洗脱。
- 常用离液盐（如GuHCl、异硫氰酸胍）增强结合效率，但需后续去除以避免PCR抑制。
- pH值
- 碱性条件（pH>8）可增强核酸与磁珠的静电作用，但需控制时间避免降解。
- 磁珠比例与样本体积
- 磁珠用量需根据样本量调整（如1μg DNA对应1μl磁珠悬液）。
- 初始体积建议≥100μL，减少移液误差。
- 优势
- 高通量：适配96孔板自动化操作，适合大规模样本处理。
- 特异性强：通过功能基团选择性捕获目标核酸。
- 快速：整个流程可在30分钟内完成。
- 注意事项
- 避免磁珠过度干燥，否则会导致结合能力下降。
- 样本裂解需充分，否则残留细胞碎片会降低纯度。
- 不同磁珠类型需匹配特定缓冲体系（如硅羟基磁珠禁用高浓度胍盐）。
- 病原体检测：快速分离病毒核酸（如新冠病毒）。
- NGS文库构建：通过片段筛选获得特定长度DNA。
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