m5C MeRIP-seq等揭示m5C修饰在癌症耐药中的关键调控机制中的应用
2025-04-24 来源:本站 点击次数:58
甲状腺未分化癌（Anaplastic Thyroid Cancer, ATC）是一种极具侵袭性的甲状腺癌，通常在初诊时就已出现局部晚期浸润或远处转移，错过了最佳手术时机。因此，系统化疗和靶向治疗对于改善ATC患者的预后至关重要。然而，ATC对传统治疗表现出显著的耐药性，这使得研究其耐药机制并发现新的治疗靶点成为当务之急。近年来，RNA修饰（尤其是m5C修饰）在肿瘤发生和耐药性中的作用逐渐受到关注，但其在ATC中的具体机制尚不清楚。
近日，天津医科大学肿瘤医院郑向前教授团队以甲状腺未分化癌（ATC）为研究对象，利用m5C MeRIP-seq等技术揭示了NSUN2介导的m5C修饰在ATC耐药性中的作用机制，阐明了NSUN2/SRSF6/UAP1信号轴在ATC多药耐药性（Multidrug Resistance, MDR）中的关键作用，并提出通过小分子NSUN2抑制剂克服耐药性的新策略。这一发现不仅为ATC的治疗提供了新的靶点，也为理解RNA修饰在肿瘤耐药性中的作用提供了重要依据。相关研究成果以《NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis》为题发表于《Theranostics》杂志。
标题：NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis（NSUN2介导的m5C修饰通过NSUN2/SRSF6/UAP1信号轴驱动可变剪切重编程并促进甲状腺未分化癌的多药耐药性）
发表时间：2025-1-27
发表期刊：Theranostics
影响因子：IF 12.4/Q1
技术平台：MeRIP-seq、scRNA-seq、bulk RNA-seq（易基因金牌技术）
本研究通过对ATC样本的bulk转录组（bulk RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行全面分析，以筛选与多药耐药性（MDR）相关的m5C修饰基因。随后进行IC50实验、流式细胞术分析，并利用Nsun2基因敲除的自发性甲状腺癌（spontaneous tumorigenic ATC）小鼠模型，证明了NSUN2在ATC中促进MDR的作用。为了探究NSUN2介导的耐药机制，研究构建了NSUN2基因敲除的ATC细胞系，并进行转录组学、蛋白质组学和MeRIP-seq分析。此外还通过RNA-seq测序和可变剪切(alternative splicing，AS)分析，研究NSUN2敲除后的整体变化。进一步通过糖蛋白染色、变性免疫沉淀泛素化、核质分离和PCR等方法，探讨了NSUN2/SRSF6/UAP1轴的潜在机制。最后在体外和体内评估了小分子NSUN2抑制剂与抗癌药物的协同效应。
研究结果表明，NSUN2表达与ATC中的MDR显著相关。NSUN2作为m5C的“writer”，ALYREF作为“reader”，它们共同作用于SRSF6 mRNA，诱导可变剪切重编程，并将UAP1基因的剪接形式从AGX1转向AGX2。结果表明，AGX2增强了ABC转运蛋白的N-糖基化，通过抑制泛素化介导的降解以稳定这些蛋白。NSUN2抑制剂通过降低NSUN2酶活性并减少下游靶标表达，为克服ATC中的MDR提供了一种新的、有前景的治疗策略。
本研究揭示了NSUN2/SRSF6/UAP1信号轴在ATC的MDR中的关键作用，并确定了NSUN2作为化疗和靶向治疗的协同靶点。
研究方法
生物信息学分析：通过分析ATC样本的bulk RNA-seq测序数据，筛选与MDR相关的m5C修饰基因。
细胞实验和分子机制研究：利用CRISPR/Cas9技术构建NSUN2基因敲除（knockout）的ATC细胞系，通过RNA-seq、蛋白质组学和MeRIP-seq分析等技术研究NSUN2的功能。
动物模型：构建Nsun2基因敲除的自发性甲状腺癌小鼠模型，评估NSUN2体内对MDR影响。
药物敏感性分析：通过IC50实验和流式细胞术检测NSUN2抑制剂与抗癌药物的联合效应。
研究结果
（1）生物信息学分析揭示ATC中NSUN2和多药耐药性（MDR）之间的相关性
通过分析Cancer Therapeutics Response Portal（CTRP）数据库中的药物敏感性数据，发现NSUN2的表达与多种抗癌药物（包括化疗药物和酪氨酸激酶抑制剂）的IC50值呈正相关。
利用GEO数据库中的ATC转录组数据，将患者分为高NSUN2表达组和低NSUN2表达组，发现高NSUN2表达与细胞分裂、有丝分裂、细胞周期等化疗靶向过程相关。
scRNA-seq测序分析显示，NSUN2在ATC细胞中的表达与多种化疗药物和TKI的耐药性相关。
图1：生物信息学分析揭示NSUN2与ATC中多药耐药性（MDR）的相关性。
A）来自CTRP数据库的ATC患者基因表达与药物敏感性的Spearman相关性分析。
B-C）高NSUN2表达组与低NSUN2表达组之间差异表达基因（DEGs）的富集通路总结。
D）ATC的scRNA-seq数据的tSNE图，展示了鉴定出的细胞clusters（n=10）。
E）散点图显示NSUN2阳性细胞与NSUN2阴性细胞的log2倍变化（log2FC）及其与每种药物预测的IC50曲线下面积（AUC）值的相关性。
F）蝴蝶图展示NSUN2表达、药物敏感性与基因本体（GO）通路分析之间的相关性。
G）ATC的scRNA-seq数据的tSNE图，展示了鉴定出的细胞clusters（n=10）。
H）使用Beyondcell对GEO数据集样本进行的单细胞药物敏感性分析。
I）NSUN2表达与Beyondcell评分之间的相关性。
（2）ATC中NSUN2诱导的MDR取决于其甲基转移酶活性
在ATC细胞系中敲低或敲除NSUN2后，细胞对多种药物的敏感性显著增加，表明NSUN2表达与MDR密切相关。
通过构建NSUN2催化活性突变体（C271A），发现只有野生型NSUN2能够恢复m5C修饰活性和药物耐受性，表明NSUN2的甲基转移酶活性是其诱导MDR的关键。
B）通过点杂交实验检测NSUN2基因敲除对Cal-62细胞mRNA转录组中m5C水平的影响。
C）通过比色法m5C定量实验确认NSUN2基因敲除后Cal-62细胞中m5C水平的变化。
D-F）通过细胞生长抑制实验评估NSUN2基因敲除对Cal-62细胞对多柔比星（doxorubicin）、顺铂（cisplatin）和仑伐替尼（lenvatinib）敏感性的影响。
G）通过Western blot分析检测Cal-62细胞经不同处理后NSUN2蛋白的相对表达量。
H）通过点杂交实验检测经载体处理后Cal-62细胞mRNA转录组中m5C丰度。
I）通过比色法m5C定量实验确认经处理后Cal-62细胞中m5C水平变化。
J-L）通过细胞生长抑制实验评估经不同载体转染的Cal-62细胞的IC50值。
M）自发性ATC小鼠模型的构建方案，包括靶向策略（左）和繁殖方案（右）。
N）小鼠基因分型结果，其中TPO-cre的DNA凝胶条带大小为130/324bp，BrafV600E为185/307bp，Trp53flox/flox为290/370bp，Nsun2flox/flox为151/212bp。
O）在基因工程小鼠中多柔比星、顺铂和仑伐替尼的给药方案。mATC（小鼠甲状腺未分化癌）。
P）散点图显示各组小鼠的最终肿瘤重量。
Q）散点图显示各组小鼠的最终肿瘤体积。
R）显示各组ATC小鼠的生存曲线。
（3）在ATC中，NSUN2介导的m5C修饰通过靶向SRSF6驱动可变剪切重编程
蛋白质组学分析显示，NSUN2敲除后，与RNA剪接相关的蛋白表达发生显著变化，其中SRSF6蛋白表达显著下调，而其mRNA水平不变。
MeRIP-seq和qPCR结果表明，NSUN2通过m5C修饰调节SRSF6 mRNA的核质转运，进而影响其蛋白表达。
通过突变SRSF6 mRNA上的m5C修饰位点，发现这些位点对SRSF6的核质转运至关重要。
B）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后TMT-MS数据的GO富集分析。
C）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后差异剪接基因的百分比剪接包含（ΔPSI）的火山图。
D）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后显著ΔPSI变化的小提琴图。
E）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后SF3A/B、U2AF核心复合体和hnRNP家族中DEG热图。
F）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后TMT-MS数据中SRSF6蛋白水平的统计分析。
G）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后指示蛋白的Western blot分析。
H）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后SRSF6基因座周围的MeRIP-seq数据的IGV轨迹图。
I）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR检测。
J）经指示载体处理的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR分析。
K）NSUN2基因敲除后Cal-62细胞中SRSF6 mRNA的核质分布qRT-PCR分析。
L）经指示载体处理的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA的核质分布。
M）经指示载体处理的Cal-62细胞中指示蛋白的Western blot分析。
N）SRSF6中的典型m5C结合位点。顶部为m5C结合位点的motif序列；底部为SRSF6中鉴定的m5C位点。
O）经指示载体处理的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR定量。
P）经指示载体处理的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA的核质分布。
（4）NSUN2通过增强ABC转运蛋白的N-糖基化促进ATC中的MDR
转录组分析和KEGG通路分析显示，NSUN2参与N-糖链生物合成过程。
通过糖蛋白染色和蛋白质印迹分析，发现NSUN2敲除后，ABC转运蛋白（ABCC1和ABCG2）的N-糖基化水平降低，蛋白稳定性下降。
流式细胞术检测显示，NSUN2敲除细胞对药物摄取增加，表明药物外排减少，耐药性降低。
B-C）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后转录数据的基因集富集分析（GSEA）。
D）总蛋白的考马斯亮蓝染色（左），NSUN2基因敲除后Cal-62细胞的糖蛋白染色结果（右）。
E-F）经或未经TM（tunicamycin）、SS（swainsonine）处理的Cal-62细胞中指示蛋白水平的Western blot分析。细胞裂解样本经或未经PNGase F处理。“G”表示N-糖基化，“DG”表示N-糖基化减少。
G）NSUN2基因敲除的Cal-62细胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H）代表性免疫组化（IHC）图像显示35例ATC组织中NSUN2、ABCG2和ABCC1的表达情况。
I-J）采用卡方检验分析NSUN2与ABCG2或ABCC1表达之间的相关性。
K-L）NSUN2与ABCG2或ABCC1的IHC评分的相关性分析。
M-N）使用NetNglyc服务器预测的ABCG2和ABCC1的潜在N-糖基化天冬酰胺位点。
O-P）分别在转染了N557Q、N388Q、N596Q或N71Q、N19Q、N310Q、N(71+310)Q突变质粒的Cal-62细胞中，通过Western blot检测ABCG2和ABCC1的表达情况。
Q-S）NSUN2基因敲除后Cal-62细胞中多柔比星、顺铂和仑伐替尼的细胞内积累情况的流式细胞仪分析。右侧显示平均荧光强度的定量结果。
（5）NSUN2通过N-糖基化增强ABC转运蛋白的稳定性
通过western blot 分析和泛素化实验，发现NSUN2敲除后，ABCC1和ABCG2的泛素化水平增加，表明N-糖基化缺失导致这些蛋白更容易被降解。
使用蛋白酶体抑制剂MG132可以部分恢复ABCC1和ABCG2的蛋白水平，进一步证实了N-糖基化对蛋白稳定性的影响。
B）NSUN2基因敲除的Cal-62细胞经不同浓度的MG132处理后，使用指定抗体进行Western blot分析。
C）经TM和MG132处理的Cal-62细胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
D）使用ImageJ软件对ABCC1和ABCG2蛋白水平进行定量分析。
E-F）经TM和MG132处理的Cal-62细胞进行ABCC1或ABCG2免疫沉淀（IP），随后使用抗泛素抗体进行Western blot分析。
G）NSUN2基因敲除且经MG132处理的Cal-62细胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H）使用ImageJ软件对ABCC1和ABCG2蛋白强度进行定量分析。
I-J）NSUN2基因敲除且经MG132处理的Cal-62细胞进行ABCC1或ABCG2免疫沉淀（IP），随后使用抗泛素抗体进行Western blot分析。
K-L）在Cal-62细胞中表达的野生型（WT）或指示的ABCG2/ABCC1突变体经125μg/mL环己酰亚胺（CHX）处理特定时间间隔后，通过Western blot进行分析。
M-N）使用ImageJ软件对ABCG2或ABCC1的蛋白强度定量分析，并以β-Actin水平归一化。
（6）NSUN2通过介导UAP1到SRSF6的可变剪切来促进N-糖基化
UAP1是N-糖基化反应中UDP-GlcNAc合成的关键酶，其有两种亚型（AGX1和AGX2）。
NSUN2敲除后，UAP1的剪接形式从AGX2转变为AGX1，导致N-糖基化活性降低。
通过过表达SRSF6，可以逆转这一剪接变化，恢复N-糖基化水平和药物耐受性。
B）Sashimi图显示NSUN2基因敲除后Cal-62细胞中UAP1剪切事件的变化。
C）对照组与NSUN2基因敲除的Cal-62细胞中UAP1剪切的RT-PCR分析。
D）自发性小鼠ATC肿瘤中UAP1的剪切事件的RT-PCR，有或没有Nsun2基因敲除。
E）经指示载体处理的Cal-62细胞中UAP1剪切事件的RT-PCR（上图）。Western blot分析了SRSF6重建（下图）。
F）检测总蛋白的考马斯亮蓝染色（左）。经指示载体处理的Cal-62细胞糖蛋白染色（右）。
G）经指示载体处理的Cal-62细胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H-J）经指示载体处理的Cal-62细胞中多柔比星、顺铂和仑伐替尼的细胞内积累情况的流式细胞仪分析。右侧显示了平均荧光强度的定量结果。
K-M）指示载体处理Cal-62细胞对多柔比星、顺铂和仑伐替尼敏感影响细胞生长抑制实验。
N-P）指示载体处理Cal-62细胞对多柔比星、顺铂和仑伐替尼反应影响的肿瘤生长曲线。
Q-S）指示载体处理Cal-62细胞对多柔比星、顺铂和仑伐替尼反应影响肿瘤最终重量。
（7）作为m5C的“reader”， ALYREF可以鉴定SRSF6并将其从细胞核转运至细胞质
通过RNA免疫沉淀（RIP）和RNA下拉实验，发现ALYREF能够直接结合m5C修饰的SRSF6 mRNA，并将其从细胞核转运至细胞质。
ALYREF的K171A突变体显著降低对m5C -SRSF6结合能力，表明ALYREF是m5C修饰的“reader”。
ALYREF敲低或过表达可以调控SRSF6的细胞核质转运和蛋白表达，进而影响药物耐受性。
C）热图显示在NSUN2基因敲除或ALYREF、YBX1和SRSF2基因敲低的Cal-62细胞中与多柔比星和顺铂耐药性相关的基因。
D）通过RIP-qPCR检测ALYREF与Cal-62细胞中SRSF6的结合。
E）通过Western blot分析从SRSF6（m5C）下拉实验中获得的指示蛋白。
F）通过RIP-qPCR比较在经指示载体处理的Cal-62细胞中，野生型ALYREF（ALYREF-WT）和K171A突变型ALYREF（ALYREF-K171A）与SRSF6的结合。
G）通过RIP-qPCR评估NSUN2基因敲除后Cal-62细胞中ALYREF与SRSF6 mRNA的结合。
H）通过RIP-qPCR评估经指示载体处理的Cal-62细胞中ALYREF与SRSF6 mRNA的结合。
I）通过qRT-PCR实验评估ALYREF基因敲低的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA的核质分布。
J）在过表达ALYREF或ALYREF-K171A突变体的Cal-62细胞中，SRSF6 mRNA的核质分布。
K）经指示载体处理的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA的核质分布。
L-N）细胞生长抑制实验评估指示载体处理对Cal-62细胞对多柔比星、顺铂和仑伐替尼反应的影响。
O）通过Western blot分析经指示载体处理的Cal-62细胞中指示蛋白的水平。
P）NSUN2基因敲除的Cal-62细胞中ALYREF的免疫荧光染色（左侧）以及核/质ALYREF分布的定量分析（右侧）。
Q）通过Western blot分析（左侧）以及相应的定量分析（右侧），展示对照组和NSUN2基因敲除的Cal-62细胞中核和质ALYREF的水平，PARP1和TUBULIN分别作为核和质标记。
（8）小分子NSUN2抑制剂增强ATC中多药敏感性
设计并合成小分子NSUN2抑制剂（NSUN2i），能够显著降低ATC细胞中的m5C水平。
NSUN2i处理后，SRSF6的核质转运受阻，UAP1剪接形式改变，N-糖基化水平降低，ABC转运蛋白稳定性下降。
体外实验和动物模型实验均显示，NSUN2i与化疗药物或TKI联合使用可以显著增强药物的抗肿瘤效果。
B）基于RT-qPCR的MeRIP检测NSUN2基因敲除的经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA的m5C富集分析。
C）通过qRT-PCR实验评估NSUN2基因敲除的经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA的核质分布。
D）通过Western blot分析NSUN2基因敲除的经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞中指示蛋白的水平。
E）RT-PCR显示经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞和ACT-1细胞中UAP1的剪接事件。
F）检测总蛋白的考马斯亮蓝染色（左），经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞和ACT-1细胞的糖蛋白染色（右）。
G）通过Western blot分析经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞和ACT-1细胞中指示蛋白的水平。
H-J）通过流式细胞仪分析经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞中多柔比星、顺铂和仑伐替尼的细胞内积累情况。右侧显示平均荧光强度的定量结果。
K-M）细胞生长抑制实验评估NSUN2抑制剂与多柔比星、顺铂或仑伐替尼联合使用对Cal-62细胞的影响。
N）展示在基因工程小鼠中NSUN2抑制剂、多柔比星、顺铂和仑伐替尼的给药方案示意图。
O）散点图显示各组小鼠的最终肿瘤重量。
P）散点图显示各组小鼠的最终肿瘤体积。
Q）显示各组ATC小鼠的生存曲线。
讨论和局限性
本研究揭示了NSUN2通过m5C修饰调节SRSF6的细胞核质转运，进而影响UAP1剪切和N-糖基化水平，最终导致ATC耐药性的机制。研究结果表明，NSUN2及其下游靶点是靶向ATC耐药性的潜在治疗靶点。
然而，NSUN2在正常细胞生理中也发挥重要作用，系统性抑制NSUN2可能会带来安全性问题。此外，如何实现NSUN2抑制剂的肿瘤特异性递送仍然是一个挑战。
易小结
本研究通过m5C MeRIP-seq和RNA-seq等分析揭示了NSUN2/SRSF6/UAP1信号轴在ATC耐药性中的作用机制，为开发新的治疗策略提供了理论依据。NSUN2抑制剂与现有抗癌药物的联合使用有望成为克服ATC耐药性的新方法。未来的研究需要进一步评估NSUN2抑制剂的安全性和有效性，并探索其在其他肿瘤类型中的潜在应用。
m5C MeRIP-seq在本研究中的重要作用
本研究的m5C MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀测序）主要用于揭示NSUN2在甲状腺未分化癌（ATC）中的作用机制，主要表现在：
（1）鉴定m5C修饰的靶基因：通过MeRIP-seq技术能够系统地分析NSUN2在ATC细胞中对mRNA的m5C修饰情况。研究发现，NSUN2能够特异性地修饰SRSF6 mRNA上的m5C位点。这一发现为后续研究NSUN2如何通过m5C修饰调控基因表达提供了直接证据。
（2）揭示m5C修饰的功能：MeRIP-seq分析显示，NSUN2介导的m5C修饰能够调节SRSF6 mRNA的细胞核质转运。具体来说，m5C修饰增强了SRSF6 mRNA从细胞核向细胞质的转运，从而促进了SRSF6蛋白的表达。这一过程对于ATC细胞的多药耐药性（MDR）至关重要。
（3）探索m5C修饰的调控机制：研究中通过MeRIP-seq结合其他实验手段（如RNA下拉实验和RIP-qPCR），揭示了ALYREF作为m5C修饰的“reader”，能够鉴定并结合m5C修饰的SRSF6 mRNA，并将其从细胞核转运到细胞质。这一发现进一步完善了m5C修饰在基因表达调控中的分子机制。
（4）验证m5C修饰的生物学意义：通过比较NSUN2敲除细胞与野生型细胞的MeRIP-seq数据，研究人员发现NSUN2敲除后SRSF6 mRNA的m5C修饰水平显著下降，同时SRSF6蛋白表达也受到抑制。这表明m5C修饰在维持SRSF6功能和ATC细胞耐药性中发挥着重要作用。
参考文献：
Hou X, Dong Q, Hao J, Liu M, Ning J, Tao M, Wang Z, Guo F, Huang D, Shi X, Gao M, Li D, Zheng X. NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis. Theranostics 2025; 15(7):2757-2777. doi:10.7150/thno.104713.
近日，天津医科大学肿瘤医院郑向前教授团队以甲状腺未分化癌（ATC）为研究对象，利用m5C MeRIP-seq等技术揭示了NSUN2介导的m5C修饰在ATC耐药性中的作用机制，阐明了NSUN2/SRSF6/UAP1信号轴在ATC多药耐药性（Multidrug Resistance, MDR）中的关键作用，并提出通过小分子NSUN2抑制剂克服耐药性的新策略。这一发现不仅为ATC的治疗提供了新的靶点，也为理解RNA修饰在肿瘤耐药性中的作用提供了重要依据。相关研究成果以《NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis》为题发表于《Theranostics》杂志。
标题：NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis（NSUN2介导的m5C修饰通过NSUN2/SRSF6/UAP1信号轴驱动可变剪切重编程并促进甲状腺未分化癌的多药耐药性）
发表时间：2025-1-27
发表期刊：Theranostics
影响因子：IF 12.4/Q1
技术平台：MeRIP-seq、scRNA-seq、bulk RNA-seq（易基因金牌技术）
本研究通过对ATC样本的bulk转录组（bulk RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行全面分析，以筛选与多药耐药性（MDR）相关的m5C修饰基因。随后进行IC50实验、流式细胞术分析，并利用Nsun2基因敲除的自发性甲状腺癌（spontaneous tumorigenic ATC）小鼠模型，证明了NSUN2在ATC中促进MDR的作用。为了探究NSUN2介导的耐药机制，研究构建了NSUN2基因敲除的ATC细胞系，并进行转录组学、蛋白质组学和MeRIP-seq分析。此外还通过RNA-seq测序和可变剪切(alternative splicing，AS)分析，研究NSUN2敲除后的整体变化。进一步通过糖蛋白染色、变性免疫沉淀泛素化、核质分离和PCR等方法，探讨了NSUN2/SRSF6/UAP1轴的潜在机制。最后在体外和体内评估了小分子NSUN2抑制剂与抗癌药物的协同效应。
研究结果表明，NSUN2表达与ATC中的MDR显著相关。NSUN2作为m5C的“writer”，ALYREF作为“reader”，它们共同作用于SRSF6 mRNA，诱导可变剪切重编程，并将UAP1基因的剪接形式从AGX1转向AGX2。结果表明，AGX2增强了ABC转运蛋白的N-糖基化，通过抑制泛素化介导的降解以稳定这些蛋白。NSUN2抑制剂通过降低NSUN2酶活性并减少下游靶标表达，为克服ATC中的MDR提供了一种新的、有前景的治疗策略。
本研究揭示了NSUN2/SRSF6/UAP1信号轴在ATC的MDR中的关键作用，并确定了NSUN2作为化疗和靶向治疗的协同靶点。
研究摘要
研究方法
生物信息学分析：通过分析ATC样本的bulk RNA-seq测序数据，筛选与MDR相关的m5C修饰基因。
细胞实验和分子机制研究：利用CRISPR/Cas9技术构建NSUN2基因敲除（knockout）的ATC细胞系，通过RNA-seq、蛋白质组学和MeRIP-seq分析等技术研究NSUN2的功能。
动物模型：构建Nsun2基因敲除的自发性甲状腺癌小鼠模型，评估NSUN2体内对MDR影响。
药物敏感性分析：通过IC50实验和流式细胞术检测NSUN2抑制剂与抗癌药物的联合效应。
研究结果
（1）生物信息学分析揭示ATC中NSUN2和多药耐药性（MDR）之间的相关性
通过分析Cancer Therapeutics Response Portal（CTRP）数据库中的药物敏感性数据，发现NSUN2的表达与多种抗癌药物（包括化疗药物和酪氨酸激酶抑制剂）的IC50值呈正相关。
利用GEO数据库中的ATC转录组数据，将患者分为高NSUN2表达组和低NSUN2表达组，发现高NSUN2表达与细胞分裂、有丝分裂、细胞周期等化疗靶向过程相关。
scRNA-seq测序分析显示，NSUN2在ATC细胞中的表达与多种化疗药物和TKI的耐药性相关。
图1：生物信息学分析揭示NSUN2与ATC中多药耐药性（MDR）的相关性。
B-C）高NSUN2表达组与低NSUN2表达组之间差异表达基因（DEGs）的富集通路总结。
D）ATC的scRNA-seq数据的tSNE图，展示了鉴定出的细胞clusters（n=10）。
E）散点图显示NSUN2阳性细胞与NSUN2阴性细胞的log2倍变化（log2FC）及其与每种药物预测的IC50曲线下面积（AUC）值的相关性。
F）蝴蝶图展示NSUN2表达、药物敏感性与基因本体（GO）通路分析之间的相关性。
G）ATC的scRNA-seq数据的tSNE图，展示了鉴定出的细胞clusters（n=10）。
H）使用Beyondcell对GEO数据集样本进行的单细胞药物敏感性分析。
I）NSUN2表达与Beyondcell评分之间的相关性。
（2）ATC中NSUN2诱导的MDR取决于其甲基转移酶活性
在ATC细胞系中敲低或敲除NSUN2后，细胞对多种药物的敏感性显著增加，表明NSUN2表达与MDR密切相关。
通过构建NSUN2催化活性突变体（C271A），发现只有野生型NSUN2能够恢复m5C修饰活性和药物耐受性，表明NSUN2的甲基转移酶活性是其诱导MDR的关键。
图2：ATC中由NSUN2诱导的MDR依赖于其甲基转移酶活性。
A）通过Western blot分析检测Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后的NSUN2蛋白表达情况。B）通过点杂交实验检测NSUN2基因敲除对Cal-62细胞mRNA转录组中m5C水平的影响。
C）通过比色法m5C定量实验确认NSUN2基因敲除后Cal-62细胞中m5C水平的变化。
D-F）通过细胞生长抑制实验评估NSUN2基因敲除对Cal-62细胞对多柔比星（doxorubicin）、顺铂（cisplatin）和仑伐替尼（lenvatinib）敏感性的影响。
G）通过Western blot分析检测Cal-62细胞经不同处理后NSUN2蛋白的相对表达量。
H）通过点杂交实验检测经载体处理后Cal-62细胞mRNA转录组中m5C丰度。
I）通过比色法m5C定量实验确认经处理后Cal-62细胞中m5C水平变化。
J-L）通过细胞生长抑制实验评估经不同载体转染的Cal-62细胞的IC50值。
M）自发性ATC小鼠模型的构建方案，包括靶向策略（左）和繁殖方案（右）。
N）小鼠基因分型结果，其中TPO-cre的DNA凝胶条带大小为130/324bp，BrafV600E为185/307bp，Trp53flox/flox为290/370bp，Nsun2flox/flox为151/212bp。
O）在基因工程小鼠中多柔比星、顺铂和仑伐替尼的给药方案。mATC（小鼠甲状腺未分化癌）。
P）散点图显示各组小鼠的最终肿瘤重量。
Q）散点图显示各组小鼠的最终肿瘤体积。
R）显示各组ATC小鼠的生存曲线。
（3）在ATC中，NSUN2介导的m5C修饰通过靶向SRSF6驱动可变剪切重编程
蛋白质组学分析显示，NSUN2敲除后，与RNA剪接相关的蛋白表达发生显著变化，其中SRSF6蛋白表达显著下调，而其mRNA水平不变。
MeRIP-seq和qPCR结果表明，NSUN2通过m5C修饰调节SRSF6 mRNA的核质转运，进而影响其蛋白表达。
通过突变SRSF6 mRNA上的m5C修饰位点，发现这些位点对SRSF6的核质转运至关重要。
图3：ATC中，NSUN2介导的m5C修饰通过靶向SRSF6驱动可变剪切重编程。
A）通过TMT-MS检测的Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后蛋白水平变化的火山图。B）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后TMT-MS数据的GO富集分析。
C）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后差异剪接基因的百分比剪接包含（ΔPSI）的火山图。
D）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后显著ΔPSI变化的小提琴图。
E）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后SF3A/B、U2AF核心复合体和hnRNP家族中DEG热图。
F）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后TMT-MS数据中SRSF6蛋白水平的统计分析。
G）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后指示蛋白的Western blot分析。
H）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后SRSF6基因座周围的MeRIP-seq数据的IGV轨迹图。
I）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR检测。
J）经指示载体处理的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR分析。
K）NSUN2基因敲除后Cal-62细胞中SRSF6 mRNA的核质分布qRT-PCR分析。
L）经指示载体处理的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA的核质分布。
M）经指示载体处理的Cal-62细胞中指示蛋白的Western blot分析。
N）SRSF6中的典型m5C结合位点。顶部为m5C结合位点的motif序列；底部为SRSF6中鉴定的m5C位点。
O）经指示载体处理的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR定量。
P）经指示载体处理的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA的核质分布。
（4）NSUN2通过增强ABC转运蛋白的N-糖基化促进ATC中的MDR
转录组分析和KEGG通路分析显示，NSUN2参与N-糖链生物合成过程。
通过糖蛋白染色和蛋白质印迹分析，发现NSUN2敲除后，ABC转运蛋白（ABCC1和ABCG2）的N-糖基化水平降低，蛋白稳定性下降。
流式细胞术检测显示，NSUN2敲除细胞对药物摄取增加，表明药物外排减少，耐药性降低。
图4：NSUN2通过增强ABC转运蛋白的N-糖基化促进ATC中的MDR。
A）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后转录数据的GO富集分析。B-C）Cal-62细胞中NSUN2基因敲除后转录数据的基因集富集分析（GSEA）。
D）总蛋白的考马斯亮蓝染色（左），NSUN2基因敲除后Cal-62细胞的糖蛋白染色结果（右）。
E-F）经或未经TM（tunicamycin）、SS（swainsonine）处理的Cal-62细胞中指示蛋白水平的Western blot分析。细胞裂解样本经或未经PNGase F处理。“G”表示N-糖基化，“DG”表示N-糖基化减少。
G）NSUN2基因敲除的Cal-62细胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H）代表性免疫组化（IHC）图像显示35例ATC组织中NSUN2、ABCG2和ABCC1的表达情况。
I-J）采用卡方检验分析NSUN2与ABCG2或ABCC1表达之间的相关性。
K-L）NSUN2与ABCG2或ABCC1的IHC评分的相关性分析。
M-N）使用NetNglyc服务器预测的ABCG2和ABCC1的潜在N-糖基化天冬酰胺位点。
O-P）分别在转染了N557Q、N388Q、N596Q或N71Q、N19Q、N310Q、N(71+310)Q突变质粒的Cal-62细胞中，通过Western blot检测ABCG2和ABCC1的表达情况。
Q-S）NSUN2基因敲除后Cal-62细胞中多柔比星、顺铂和仑伐替尼的细胞内积累情况的流式细胞仪分析。右侧显示平均荧光强度的定量结果。
（5）NSUN2通过N-糖基化增强ABC转运蛋白的稳定性
通过western blot 分析和泛素化实验，发现NSUN2敲除后，ABCC1和ABCG2的泛素化水平增加，表明N-糖基化缺失导致这些蛋白更容易被降解。
使用蛋白酶体抑制剂MG132可以部分恢复ABCC1和ABCG2的蛋白水平，进一步证实了N-糖基化对蛋白稳定性的影响。
图5：NSUN2通过N-糖基化增强ABC转运蛋白的稳定性。
A）Cal-62细胞经TM或不同浓度的MG132处理后，使用指定抗体进行Western blot分析。B）NSUN2基因敲除的Cal-62细胞经不同浓度的MG132处理后，使用指定抗体进行Western blot分析。
C）经TM和MG132处理的Cal-62细胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
D）使用ImageJ软件对ABCC1和ABCG2蛋白水平进行定量分析。
E-F）经TM和MG132处理的Cal-62细胞进行ABCC1或ABCG2免疫沉淀（IP），随后使用抗泛素抗体进行Western blot分析。
G）NSUN2基因敲除且经MG132处理的Cal-62细胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H）使用ImageJ软件对ABCC1和ABCG2蛋白强度进行定量分析。
I-J）NSUN2基因敲除且经MG132处理的Cal-62细胞进行ABCC1或ABCG2免疫沉淀（IP），随后使用抗泛素抗体进行Western blot分析。
K-L）在Cal-62细胞中表达的野生型（WT）或指示的ABCG2/ABCC1突变体经125μg/mL环己酰亚胺（CHX）处理特定时间间隔后，通过Western blot进行分析。
M-N）使用ImageJ软件对ABCG2或ABCC1的蛋白强度定量分析，并以β-Actin水平归一化。
（6）NSUN2通过介导UAP1到SRSF6的可变剪切来促进N-糖基化
UAP1是N-糖基化反应中UDP-GlcNAc合成的关键酶，其有两种亚型（AGX1和AGX2）。
NSUN2敲除后，UAP1的剪接形式从AGX2转变为AGX1，导致N-糖基化活性降低。
通过过表达SRSF6，可以逆转这一剪接变化，恢复N-糖基化水平和药物耐受性。
图6：NSUN2通过SRSF6介导UAP1的可变剪切促进N-糖基化。
A）UAP1促进UDP-GlcNAc的生物合成，UDP-GlcNAc是糖基化反应中的关键供体，尤其在N-糖基化和O-GlcNAc修饰中。B）Sashimi图显示NSUN2基因敲除后Cal-62细胞中UAP1剪切事件的变化。
C）对照组与NSUN2基因敲除的Cal-62细胞中UAP1剪切的RT-PCR分析。
D）自发性小鼠ATC肿瘤中UAP1的剪切事件的RT-PCR，有或没有Nsun2基因敲除。
E）经指示载体处理的Cal-62细胞中UAP1剪切事件的RT-PCR（上图）。Western blot分析了SRSF6重建（下图）。
F）检测总蛋白的考马斯亮蓝染色（左）。经指示载体处理的Cal-62细胞糖蛋白染色（右）。
G）经指示载体处理的Cal-62细胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H-J）经指示载体处理的Cal-62细胞中多柔比星、顺铂和仑伐替尼的细胞内积累情况的流式细胞仪分析。右侧显示了平均荧光强度的定量结果。
K-M）指示载体处理Cal-62细胞对多柔比星、顺铂和仑伐替尼敏感影响细胞生长抑制实验。
N-P）指示载体处理Cal-62细胞对多柔比星、顺铂和仑伐替尼反应影响的肿瘤生长曲线。
Q-S）指示载体处理Cal-62细胞对多柔比星、顺铂和仑伐替尼反应影响肿瘤最终重量。
（7）作为m5C的“reader”， ALYREF可以鉴定SRSF6并将其从细胞核转运至细胞质
通过RNA免疫沉淀（RIP）和RNA下拉实验，发现ALYREF能够直接结合m5C修饰的SRSF6 mRNA，并将其从细胞核转运至细胞质。
ALYREF的K171A突变体显著降低对m5C -SRSF6结合能力，表明ALYREF是m5C修饰的“reader”。
ALYREF敲低或过表达可以调控SRSF6的细胞核质转运和蛋白表达，进而影响药物耐受性。
图7：ALYREF作为m5C “reader”，能够鉴定并介导SRSF6从细胞核到细胞质的转运。
A-B）GSEA分析表明ALYREF的表达与化疗耐药性相关。C）热图显示在NSUN2基因敲除或ALYREF、YBX1和SRSF2基因敲低的Cal-62细胞中与多柔比星和顺铂耐药性相关的基因。
D）通过RIP-qPCR检测ALYREF与Cal-62细胞中SRSF6的结合。
E）通过Western blot分析从SRSF6（m5C）下拉实验中获得的指示蛋白。
F）通过RIP-qPCR比较在经指示载体处理的Cal-62细胞中，野生型ALYREF（ALYREF-WT）和K171A突变型ALYREF（ALYREF-K171A）与SRSF6的结合。
G）通过RIP-qPCR评估NSUN2基因敲除后Cal-62细胞中ALYREF与SRSF6 mRNA的结合。
H）通过RIP-qPCR评估经指示载体处理的Cal-62细胞中ALYREF与SRSF6 mRNA的结合。
I）通过qRT-PCR实验评估ALYREF基因敲低的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA的核质分布。
J）在过表达ALYREF或ALYREF-K171A突变体的Cal-62细胞中，SRSF6 mRNA的核质分布。
K）经指示载体处理的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA的核质分布。
L-N）细胞生长抑制实验评估指示载体处理对Cal-62细胞对多柔比星、顺铂和仑伐替尼反应的影响。
O）通过Western blot分析经指示载体处理的Cal-62细胞中指示蛋白的水平。
P）NSUN2基因敲除的Cal-62细胞中ALYREF的免疫荧光染色（左侧）以及核/质ALYREF分布的定量分析（右侧）。
Q）通过Western blot分析（左侧）以及相应的定量分析（右侧），展示对照组和NSUN2基因敲除的Cal-62细胞中核和质ALYREF的水平，PARP1和TUBULIN分别作为核和质标记。
（8）小分子NSUN2抑制剂增强ATC中多药敏感性
设计并合成小分子NSUN2抑制剂（NSUN2i），能够显著降低ATC细胞中的m5C水平。
NSUN2i处理后，SRSF6的核质转运受阻，UAP1剪接形式改变，N-糖基化水平降低，ABC转运蛋白稳定性下降。
体外实验和动物模型实验均显示，NSUN2i与化疗药物或TKI联合使用可以显著增强药物的抗肿瘤效果。
图8：小分子NSUN2抑制剂增强ATC对多药的敏感性。
A）通过点杂交实验评估NSUN2基因敲除的经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞中mRNA的m5C水平。B）基于RT-qPCR的MeRIP检测NSUN2基因敲除的经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA的m5C富集分析。
C）通过qRT-PCR实验评估NSUN2基因敲除的经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞中SRSF6 mRNA的核质分布。
D）通过Western blot分析NSUN2基因敲除的经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞中指示蛋白的水平。
E）RT-PCR显示经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞和ACT-1细胞中UAP1的剪接事件。
F）检测总蛋白的考马斯亮蓝染色（左），经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞和ACT-1细胞的糖蛋白染色（右）。
G）通过Western blot分析经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞和ACT-1细胞中指示蛋白的水平。
H-J）通过流式细胞仪分析经或未经NSUN2抑制剂处理的Cal-62细胞中多柔比星、顺铂和仑伐替尼的细胞内积累情况。右侧显示平均荧光强度的定量结果。
K-M）细胞生长抑制实验评估NSUN2抑制剂与多柔比星、顺铂或仑伐替尼联合使用对Cal-62细胞的影响。
N）展示在基因工程小鼠中NSUN2抑制剂、多柔比星、顺铂和仑伐替尼的给药方案示意图。
O）散点图显示各组小鼠的最终肿瘤重量。
P）散点图显示各组小鼠的最终肿瘤体积。
Q）显示各组ATC小鼠的生存曲线。
图9：NSUN2在ATC多药耐药中的功能和机制示意图模型。
讨论和局限性
本研究揭示了NSUN2通过m5C修饰调节SRSF6的细胞核质转运，进而影响UAP1剪切和N-糖基化水平，最终导致ATC耐药性的机制。研究结果表明，NSUN2及其下游靶点是靶向ATC耐药性的潜在治疗靶点。
然而，NSUN2在正常细胞生理中也发挥重要作用，系统性抑制NSUN2可能会带来安全性问题。此外，如何实现NSUN2抑制剂的肿瘤特异性递送仍然是一个挑战。
易小结
本研究通过m5C MeRIP-seq和RNA-seq等分析揭示了NSUN2/SRSF6/UAP1信号轴在ATC耐药性中的作用机制，为开发新的治疗策略提供了理论依据。NSUN2抑制剂与现有抗癌药物的联合使用有望成为克服ATC耐药性的新方法。未来的研究需要进一步评估NSUN2抑制剂的安全性和有效性，并探索其在其他肿瘤类型中的潜在应用。
m5C MeRIP-seq在本研究中的重要作用
本研究的m5C MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀测序）主要用于揭示NSUN2在甲状腺未分化癌（ATC）中的作用机制，主要表现在：
（1）鉴定m5C修饰的靶基因：通过MeRIP-seq技术能够系统地分析NSUN2在ATC细胞中对mRNA的m5C修饰情况。研究发现，NSUN2能够特异性地修饰SRSF6 mRNA上的m5C位点。这一发现为后续研究NSUN2如何通过m5C修饰调控基因表达提供了直接证据。
（2）揭示m5C修饰的功能：MeRIP-seq分析显示，NSUN2介导的m5C修饰能够调节SRSF6 mRNA的细胞核质转运。具体来说，m5C修饰增强了SRSF6 mRNA从细胞核向细胞质的转运，从而促进了SRSF6蛋白的表达。这一过程对于ATC细胞的多药耐药性（MDR）至关重要。
（3）探索m5C修饰的调控机制：研究中通过MeRIP-seq结合其他实验手段（如RNA下拉实验和RIP-qPCR），揭示了ALYREF作为m5C修饰的“reader”，能够鉴定并结合m5C修饰的SRSF6 mRNA，并将其从细胞核转运到细胞质。这一发现进一步完善了m5C修饰在基因表达调控中的分子机制。
（4）验证m5C修饰的生物学意义：通过比较NSUN2敲除细胞与野生型细胞的MeRIP-seq数据，研究人员发现NSUN2敲除后SRSF6 mRNA的m5C修饰水平显著下降，同时SRSF6蛋白表达也受到抑制。这表明m5C修饰在维持SRSF6功能和ATC细胞耐药性中发挥着重要作用。
参考文献：
Hou X, Dong Q, Hao J, Liu M, Ning J, Tao M, Wang Z, Guo F, Huang D, Shi X, Gao M, Li D, Zheng X. NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis. Theranostics 2025; 15(7):2757-2777. doi:10.7150/thno.104713.
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