Author：Katharina Meditz and Beate Rinner

1 原代肿瘤细胞培养的重要性：尽可能接近体内
乔治和玛格丽特·盖花了近30年的时间试图建立一个不朽的人类细胞系，以了解肿瘤的生物学和机理。在建立了组织培养实验室后，乔治·盖伊取得了巨大的突破——他从宫颈癌中分离出了第一个肿瘤细胞系，他将其命名为HeLa。乔治·盖伊（GeorgeGey）总是说：“癌症的关键就在我们的指尖上——只要我们能伸手抓住它”。不幸的是，他死于胰腺肿瘤。

自从发现细胞系以来，它们的重要性一直在持续，甚至在增加。原因如下：（i）它们易于处理，（ii）它们提供无限的自我复制，（iii）它们具有相对较高的同质性，（iv）它们很容易从冷冻库存中替换。因为（i）细胞系在传代过程中容易发生基因型和表型漂移，（ii）细胞系在多年内储存不好，（iii）细胞系亚群引起表型变化，以及（iv），所以没有阳性而没有阴性来自不同实验室的细胞系显示不同的核型，因此可能缺乏重复性。

1.1 细胞培养定义
原代培养是直接取自组织的初始培养；它最接近原始组织，是研究的基础。细胞可以直接从组织中迁移和生长（外植体技术），或者细胞可以通过酶或机械方法从肿瘤组织中分离出来。就其生长行为而言，细胞可以作为贴壁培养物在体外生长，也可以悬浮生长。

肿瘤细胞生长并覆盖整个细胞培养瓶后，必须将细胞转移到新的细胞培养瓶中，原代肿瘤细胞的命名发生变化，成为细胞系。有两类细胞系，一类是种群无限膨胀的连续细胞系，另一类是具有一定寿命的有限细胞系。目前，在细胞库中有大量不同的细胞系，这些细胞系具有很好的特征。然而，建立新的细胞系仍然是有用的，因为异质性肿瘤需要不同的细胞系系统来研究肿瘤的生物学特性。培养时间很长的细胞系可以改变其遗传和表型特征。

2 从组织到所需细胞的长距离
从组织到所需的细胞可能需要很多时间，也可能非常棘手；取决于细胞的生长行为和现有组织中肿瘤细胞的数量。本章概述了肿瘤组织、培养基和细胞分离。通过使用肿瘤生长方面的对比实例，将解释从非常侵袭性的NRAS黑色素瘤肿瘤中建立名为MUG-Mel2的细胞系以及建立非常缓慢生长的脊索瘤肿瘤，名为MUG-Chor1和MUG-CC1。

2.1 肿瘤组织
拉丁语单词tumor的翻译是“肿胀”。著名病理学家Wallace H.Clark对单词tumor给出了极好的定义：“肿瘤是一组异常细胞，其特征是在时间上不受限制地生长，并且能够在至少三个不同的组织隔室中生长——原始隔室、原发部位的间质（肿瘤侵袭）和远处的间质（肿瘤转移）”。实体瘤的结构为实质（肿瘤细胞）和间质细胞（周围的肿瘤细胞）。来源于上皮的肿瘤可以显示出这些间隔与基底层的分离。这意味着肿瘤不仅存在于恶性细胞，还存在许多其他细胞。肿瘤微环境（TME）也是必不可少的.根据肿瘤实体的不同，TME可能由免疫系统细胞、血管和淋巴管细胞、成纤维细胞、周细胞和脂肪细胞组成，数量差异很大[2].一些细胞很容易通过典型的形态进行区分，如上皮部分，主要是具有典型鹅卵石形态的单个细胞，基质部分由成纤维细胞组成，细胞具有典型的成纤维细胞双极纺锤形；免疫细胞在粘附细胞或肥大细胞/macr上方呈现球状细胞棺材。

手术后应立即获取肿瘤组织，移除周围的肿瘤组织，为避免污染，应在PBS+10%PS中进行10分钟的抗生素浴。抗生素浴后，将肿瘤组织转移到PBS或培养基中，然后用剪刀或手术刀b将组织切成非常小的碎片（1–2 mm³）。将肿瘤组织分解成小块c后，收集悬浮液，并将PBS或培养基中的肿瘤块离心。如果方案中有规定，则将切碎的肿瘤组织d旋转，并在适当的培养基中设置不同的部分。

2.2 成功的四个步骤
在第一步中，肿瘤组织的状况非常重要。缺血时间短是一个优势，但只要组织在培养基中保持低温（4°C），你可以在手术后24小时从组织中分离细胞。从手术到实验室的组织运输应在不含任何添加剂的介质中进行，如血清（FBS）或抗生素，以防止其干燥。无FBS对于在运输过程中抑制细胞生长很重要。无抗生素，因为在实验室中，每个组织将在10次抗生素浴中培养10分钟，以避免污染，如果运输介质中含有抗生素，则无法确定抗生素浓度和培养时间。活细胞只能从新鲜的活肿瘤组织中分离出来。

创建细胞系的第二步是知道要分离哪种细胞，然后跟踪它们！良好的本能是成功建立细胞系的必要条件。

在第三步中，每个肿瘤都需要自己的分离方法，而这种方法和培养基在大多数文献中都可以找到。一种非常普遍的方法是机械分离或用剪刀或锋利的刀片将组织切割成非常小的碎片——通常为1-2 mm³，可以选择通过尼龙过滤器（50-100 μm开口）过滤均质，旋转并重复这些步骤以去除死细胞、碎片，以及各种不同的细胞类型。

我们必须意识到，在分离肿瘤细胞的过程中，可能会有不同数量的非肿瘤细胞，这将使肿瘤细胞系的建立复杂化。因此，由病理学家检查肿瘤的组织切片以确定存在的肿瘤细胞的比例非常重要，因为这将影响细胞系生长的成功。酶解也是分离单个细胞的一种方法：有不同的酶适合将细胞从实体瘤中分离出来，并将切碎的组织消化成单个细胞。酶的浓度、温度和培养时间对保持细胞活力和完整性非常重要。有多种酶可用，包括胶原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和弹性蛋白酶。每种具有不同靶点的酶对不同的肿瘤具有亲和力。

第四步，每个细胞需要自己的培养基；因此，在建立任何细胞系之前，对所有文献进行彻底研究是一个先决条件。有多种可用的基本培养基，可以通过不同的添加剂来适应细胞的需要。然而，在生产特定介质时，必须注意保持渗透压。例如，FBS的增加（从10%增加到30%）会强烈影响介质的渗透压。相比之下，人体血液的渗透值为300 mOsmolkg^-1，大多数基本培养基的渗透值为280–340 mOsmolkg^−1。 通过培养基中的添加剂，例如ITS，重组人胰岛素、人转铁蛋白和亚硒酸钠的混合物，有不同的方法促进细胞的粘附或生长。细胞的粘附也可以通过在细胞培养瓶中涂上各种酶（如纤维连接蛋白或基质凝胶）来加强。

2.3 方案：建立贴壁生长肿瘤的肿瘤细胞系

• 肿瘤组织的制备：用无菌剪刀或手术刀去除非肿瘤组织（脂肪组织、血凝块和结缔组织）。
• 为降低污染风险，建议使用10×PS溶液的抗生素浴，培养约10分钟。
• 将肿瘤组织从抗生素浴转移到PBS或培养基中。
• 用无菌镊子、剪刀或手术刀将肿瘤机械和/或酶分解成非常小的碎片，以获得更多的表面以供肿瘤细胞生长。
• 可选：肿瘤块的涡流。
• 离心并除去上清液。
• 用合适的培养基在不同的细胞培养瓶中重新培养（由于培养瓶的过滤作用，细胞可能比在6孔培养皿中生长得更好）
• 在37°C的加湿培养箱中，在CO₂气氛中培养细胞（CO₂量取决于所用培养基）。
• 定期对肿瘤细胞进行形态学观察。
• 当整个细胞培养瓶过度生长并消耗培养基时，需要进行传代培养（分裂）。
• 亚培养：使用蛋白水解酶（如胰蛋白酶）或更温和的Accutase使粘附单层脱离。电池接触中断，电池处于悬浮状态；离心后，可将细胞接种到具有适当细胞量的新烧瓶和新的新鲜培养基中，以继续细胞生长。

2.4 特性描述
肿瘤组织中存在大量不同的细胞，因此尽快对生长出的细胞进行定性是非常重要的。癌细胞的一个特征是复制不朽，这意味着癌细胞的分裂能力是正常细胞的数倍。通常只有成纤维细胞在肿瘤细胞上发育和生长。成纤维细胞也有能力在培养物中保持很长时间，在培养物中最多可传代50代。成纤维细胞的问题在于，它们的形态并不总是可识别的，而且成纤维细胞常常被错误地与肿瘤细胞混淆。由于这些原因，必须尽快检测肿瘤潜能。在大多数情况下，一开始只有很少的肿瘤细胞可用，并且表征方法必须与细胞数量相适应。在第一个生长阶段，只能进行形态学观察。所建立的细胞系应具有与起源组织相同的特征，然而，例如，可以用波形蛋白检测间充质起源，用细胞角蛋白检测上皮特征。为了检测细胞的肿瘤潜能，可以进行集落形成单位分析；该分析只需要少量细胞，并通过克隆生长显示细胞的肿瘤潜能。肿瘤细胞表现为非整倍体和染色体不稳定性，流式细胞术的细胞周期分析可以揭示细胞的倍体状态，而核型分析则揭示肿瘤细胞的染色体不稳定性。肿瘤标志物和遗传图谱在培养过程中应保持恒定表达；然而，一些标记可能在栽培过程中丢失。为了确认已建立的细胞系是从起源组织中发展而来，强烈建议通过STR分析进行DNA分析，以证明肿瘤的身份。

3 关于建立肿瘤细胞系的一般提示
一般来说，为了产生肿瘤细胞系，细胞应该（i）定期冷冻保存，（ii）传代100次以上并在培养物中保留12个月以上，（iii）在培养过程中主要保持其遗传表型和形态。

3.1 Hayflick问题
种植过程中的一个问题是所谓的Hayflick限制。伦纳德·海弗利克（Leonard Hayflick）和保罗·穆尔海德（Paul Moorhead）发现，来自胚胎组织的人类细胞在培养基中只能分裂有限次。细胞培养分为三个阶段。来自外植体或组织的细胞生长被称为第一阶段。细胞分裂代表第二阶段。然后细胞在培养基中增殖，这取决于细胞类型，在一段时间后，细胞开始分裂更慢，也可以停止分裂，这被定义为第三阶段。Hayflick和Moorhead将生长停滞现象描述为Hayflick极限或复制性衰老。如果细胞减少或停止分裂，应将其转移到具有更高细胞密度的新烧瓶中，FBS浓度可短时间增加，强烈建议仅改变50%的培养基，以保持自体生长因子的培养。培养快速生长的细胞比培养缓慢生长的细胞容易得多；然而，细胞可以毫无理由地停止分裂。

3.2 去除其他细胞

肿瘤组织中存在许多不同的细胞。为了去除非致瘤细胞，可以使用选择性粘附和分离技术。成纤维细胞和肿瘤细胞呈现不同的密度和大小；胰蛋白酶化后，细胞可以转移到新的细胞培养瓶中。经过一段时间（例如，10分钟–2小时），某些细胞将沉降到底部，剩余的培养基应移到新的烧瓶中，并可重复上述过程。从肿瘤中分离出的细胞的不同部分也非常有用，如本例中所示，用于建立MUG-Chor1。保持所有的部分都在培养中，希望其中一部分肿瘤细胞开始生长！上述成纤维细胞分离以及提取的部分意味着在细胞系建立期间培养箱中一次可容纳30多个烧瓶。因此，需要记录每个烧瓶的完整描述。原始文化最重要的一点是，在修炼过程中不要丢弃任何东西，要有耐心！在下一篇文章中，将讨论三种肿瘤细胞系的建立。

4 肿瘤细胞系的建立：三例
4.1 脊索瘤细胞系的建立
脊索瘤是一种罕见的恶性肿瘤，起源于脊索的胚胎残余，仅发生于斜坡至骶骨的中线。手术加放疗是标准治疗方法。由于脊索瘤对标准化疗具有耐药性，因此迫切需要建立更多的脊索瘤细胞系来寻找替代治疗方案。脊索瘤和由此产生的细胞系的特征是根据其形态，由各种溶酶体、液泡和典型的含藻体表达。免疫组化显示brachyury和细胞角蛋白8阳性，并显示缓慢的生长动力学。建立脊索瘤细胞系非常困难，因为肿瘤细胞生长非常缓慢，并且被其他快速生长的细胞包围，例如基质细胞和免疫细胞。为了去除成纤维细胞，可以使用选择性粘附和分离技术。

4.1.1 骶骨脊索瘤细胞系MUG-Chor1的建立
为了建立脊索瘤细胞系，手术后立即获取肿瘤组织。在将肿瘤组织机械分解成约1–2 mm³块后，将培养物的混合物分为几部分进行。组分I含有机械分离的肿瘤细胞。在37℃下用200 μL胶原酶对肿瘤片进行酶处理30分钟后，组分II包含一个细胞组分，组分III仅包含肿瘤片，用盖玻片压下，以促进细胞生长到细胞培养瓶中。所有组分均在含有10%胎牛血清、1%胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠（ITS）、2 mM谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的Iscove/RPMI 4:1中培养。在37℃下，在5% CO₂的增湿大气中进行培养。脊索瘤细胞在pH值为7.4时生长。经过4个月的培养期和5次传代后，细胞出现危机。FBS浓度从10%增加到20%，ITS浓度从1%增加到5%。在应用这些条件1周后，再次使用初始培养基。危机过后，细胞持续生长，并显示出大约7-10天的倍增时间。每周更换两次培养基，每10天在70–80%的汇合点进行细胞培养的分裂。通过PCR定期检查所有细胞培养物中的支原体。

4.1.2 斜坡脊索瘤细胞系MUG-CC1的建立
建立肿瘤细胞系的另一个问题是在肿瘤手术期间维持细胞的活力。各种手术技术，例如，电切镜，可以对细胞的活力产生影响；此外，斜坡脊索瘤细胞由于生长缓慢和肿瘤的位置，很难建立。因此，选择了一种特别小心的手术方法。格拉茨医科大学的跨学科颅底单元为四手经鼻蝶窦内窥镜手术的发展做出了重大贡献。重点在于仔细的组织保存和获取足够的细胞材料，作为最佳细胞培养的先决条件。在适当进入斜坡区并暴露肿瘤后，进行初步肿瘤去瘤。这种手术方法的特殊优势在于直接显示病变，并有机会从活体肿瘤块中获得无污染（血液、粘液、粘膜等）和结构完整的肿瘤组织。用于建立细胞系的原代细胞取自一名72岁男性患者，该患者因右侧外展神经麻痹而被转诊到神经外科，导致双眼失明、眩晕和头晕。机械分离后，细胞处于生命状态，但生长缓慢。

如果感兴趣的细胞表现出非常缓慢的生长行为，则存在其他细胞消耗培养基并取代肿瘤细胞的风险。从培养开始就立即分离细胞也很棘手，因为它们需要周围细胞中的生长因子和细胞因子。在建立细胞系MUG-CC1的过程中，B细胞过度生长，肿瘤细胞开始死亡，原因可能是快速生长的B细胞的培养基消耗或两种细胞系的不协调。

悬浮细胞容易与贴壁细胞分离。然而，正确的分离时间点很重要；否则，肿瘤培养就会丢失。在那个时间点，当悬浮细胞和贴壁细胞一起培养时，可能会发生致命的错误；在某些情况下，人们错误地认为自发永生的悬浮细胞可能是肿瘤细胞。因此，悬浮细胞的表征非常重要。

在通过形态学建立MUG-CC1的过程中，淋巴母细胞样细胞系（LCL）的特征是，淋巴母细胞样细胞与单个细胞一起以典型的花环形态在悬浮群中生长。流式细胞术分析显示B细胞标记物（CD19）呈阳性，而T细胞（CD3）和自然杀伤细胞（CD56）的标记物缺失。细胞的DNA含量也可用于表征，而肿瘤细胞主要表现为非整倍体DNA含量，淋巴母细胞表现为二倍体DNA图谱。拷贝数谱显示了一个平衡的谱，表明是一个非致瘤细胞系。在MUG-CC1-LCL中检测到EBV（TC 70和TC 72）的EB2（BMLf1）基因强阳性，表明EBV转染，并解释了永生状态。

4.2 侵袭性生长黑色素瘤细胞系MUG-Mel2的建立
细胞系MUG-Mel2是从一名48岁男性皮肤原发性溃疡性黑色素瘤（8.5 mm厚）患者的皮肤转移的新鲜标本中获得的。原发肿瘤和皮肤转移的遗传分析显示NRASQ61R基因突变；未检测到BRAF或c-kit突变。肿瘤和已建立的细胞系表达黑色素瘤标记物，如Melan-A、HMB-45、S100和酪氨酸酶。手术后立即获得肿瘤组织（皮肤转移）；在将肿瘤组织机械分解成约1–2 mm³块后，将细胞培养在含有10% FBS、2 mmL-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的RPMI（加州卡尔斯巴德生命技术公司）中。黑色素瘤细胞在pH值为7.4时生长。细胞生长至80%汇合，并用Accutase从烧瓶中分离。特别是在培养开始期间，细胞应保持在非常高的密度，以促进细胞间的接触和细胞生长。所有细胞的培养均在37°C、5% CO₂的增湿空气中进行。定期检查所有细胞

通过PCR检测支原体。图4.6显示了从培养开始，在黑色素瘤和周围成纤维细胞样细胞中常见的具有三角形树突形态的突出细胞。由于黑色素瘤细胞的快速生长，其他细胞如成纤维细胞被取代。10天后，进一步培养纯黑色素瘤细胞，并且上述所有黑色素瘤标记物能够保持在培养基中。

5 质量检查

5.1 记录和冻结
细胞系建立过程中最重要的任务是保存细胞培养工作的完整文档。每个实验室都应创建合适的标签模式。对于每个细胞系，应使用单独的等分培养基烧瓶。此外，还必须遵守有效期。必须在培养开始期间进行形态学观察和拍照，并定期进行冷冻保存，以获得不同传代的冷冻材料。对于低温保存，建议使用90% FBS和10% DMSO的混合物。不要冷冻到更少的细胞；如果你有少量的细胞，使用体积较小的冷冻瓶。

5.2 污染
细胞培养中存在多种污染，分为两个主要领域：微生物和细胞间污染。你在一种文化中工作的越多，污染的风险就越大。一次只能处理一个细胞系，尤其是处理原代细胞时。需要无菌技术来防止微生物污染。

5.2.1 微生物污染
细胞培养中的主要污染物是细菌、支原体、真菌、酵母和病毒。污染源可能是不良的无菌技术、介质添加剂或肿瘤组织（例如支原体）。必须对污染进行监测和测试。易于检测的有细菌（浊度增加或混浊、细颗粒、移动）、酵母（短链的小椭圆形生物体）和真菌（细丝状菌丝体），而支原体和病毒更难检测。支原体是小型原核生物，显微镜下无法观察到它们的存在。支原体污染的后果可能包括生长速率效应，染色体改变核酸和氨基酸合成，以及膜改变。许多不同的支原体检测方法在成本、时间、可靠性、特异性和敏感性方面都有优势和劣势。PCR和ELISA技术为检测支原体提供了一种非常敏感、特异和快速的选择，同时覆盖了广泛的支原体检测范围。最难检测的污染是病毒污染，但除非是细胞病变，否则它们可能对宿主细胞几乎没有影响。

5.2.2 细胞污染
“假”细胞系——30多年前，通过证明细胞系被HeLa细胞污染，强调了培养中细胞的交叉污染。特别是在使用原电池时，很容易发生电池间污染。细胞错误识别的原因可能是人为错误（错误标记、未消毒的工作条件、交叉污染）或所用技术的不良结果（使用饲养层或异种移植）。你在一种文化中工作的越多，污染的风险就越大。一次只能处理一个细胞系，并确保每个细胞系都有自己的培养基、胰蛋白酶和PBS。特别是贴壁细胞由于其形态可以保持分离，但原代细胞的形态尚不清楚。为了确保使用正确的细胞，应该进行DNA分析。STR DNA分析技术用于人类细胞系、干细胞和组织的常规鉴定（鉴定）。STR分析是指短串联重复序列DNA，用于检测DNA中的各个区域。某些DNA区域的差异可以用来区分个体。然而，人类STR分析仅限于物种鉴定。这意味着无法识别来自其他物种（如小鼠或大鼠）的细胞系的污染。在基于人类的STR分析中，未检测到非人类DNA的存在。动物物种可以通过同工酶分析来检测。即使在建立细胞系的过程中，交叉污染的风险也非常高！因此，切勿同时处理原代细胞培养和连续细胞系。