通常，细胞类型中基因的激活不是“有”或“无”，特定的基因标记意味着启动子的活性在这种细胞类型中相对较高，而在其他细胞中，目的启动子也可能被弱激活，这种现象也被叫做异位表达。异位表达对谱系追踪的影响很大，常常会导致一些关于细胞命运的争议。
 

图.异位表达对谱系示踪的影响^[1]

上一期，我们讲述了双重组酶介导的交叉报告基因类型，这种类型常用于标记双阳性的细胞类型，而本次课程，我们来讲述可以用于避免基因标记异位表达的独家报告基因系统。

谱系示踪系类课程往期回顾：
【谱系示踪系列第一期】基础细胞标记方式
【谱系示踪系列第二期】单重组酶介导的多色报告系统方法
【谱系示踪系列第三期】多重组酶介导的交叉报告基因方法

独家报告基因系统

独家报告基因系统的结构是 Promoter-site1-site2-Stop-site1-reporter A-Stop-site2-reporter B。这类系统是利用两个重组系统，将两对识别位点错落的分布在两个报告基因两端。如果首先发生一个重组，则相应报告基因的表达将去除另一个重组系统的一个识别位点。换句话说，这个系统会防止同一细胞中发生二次重组。

独家报告基因小鼠的基因重组，存在先后顺序，可能会出现以下两种情况：

情况一
A-Cre 先表达，B-DreERT2 后续通过 Tamoxifen 诱导表达。
 

当A-cre先表达时：

1 A⁺细胞：
makerA 介导 Cre 酶表达，Cre 酶会切除两个 loxP 位点之间的序列（第一个 stop 序列与第一个 Rox 位点被切除）。该系统按照启动子的方向，表达绿色荧光 ZsGreen。

2 A^- 细胞：
该系统未发生重组，按照启动子的方向，遇到第一个 stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

之后，使用 Tamoxifen 诱导 B-DreERT2 时：

1 A⁺ 细胞：
由于该系统中的第一个 Rox 位点被切除，无论细胞是否表达makerB，该系统均只表达绿色荧光 ZsGreen。

2 A^-B⁺ 细胞：
makerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶会切除两个 Rox 位点之间的序列（绿色荧光 ZsGreen、第二个 Loxp 位点与第二个 stop 序列被切除），之后，该系统按照启动子的方向，表达红色荧光 tdTomato。

3 A^-B^- 细胞：
该系统按照启动子的方向，遇到 stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

因此，A⁺细胞可被标记为绿色。A^-B⁺细胞可被标记为红色。

情况二
B-Dre 先表达，A-CreERT2 后续通过 Tamoxifen 诱导表达。

当B-Dre先表达时：
1 B⁺细胞：
makerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶会切除两个 Rox 位点之间的序列（绿色荧光 ZsGreen、第二个 Loxp 位点与第二个 stop 序列被切除）。该系统按照启动子的方向，表达红色荧光 tdTomato。

2 B^- 细胞：
该系统未发生重组，按照启动子的方向，遇到第一个 stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

之后，使用 Tamoxifen 诱导 B-DreERT2 时：

1 B⁺ 细胞：
由于该系统中的第一个 Loxp 位点被切除，无论细胞是否表达makerA，该系统均只表达红色荧光 tdTomato。

2 A⁺B^- 细胞：
makerA 介导 Cre 酶表达，Cre 酶会切除两个 loxP 位点之间的序列（第一个 stop 序列与第一个 Rox 位点被切除）。该系统按照启动子的方向，表达绿色荧光 ZsGreen。

3 A^-B^- 细胞：
该系统按照启动子的方向，遇到 stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

因此，B⁺细胞可被标记为红色。A⁺B^-细胞可被标记为绿色。

我们使用独家报告基因小鼠，如何避免基因标记的异位表达呢？显然，独家报告基因小鼠可帮助您标记 A⁺B^-（反之亦然）的细胞类型，因此，若我们想标记 MarkerA 的细胞，但 A 基因出现了异位表达，那我们可以利用在非目的细胞中特异性表达的 MarkerB，使用独家报告基因系统将其标记为其他颜色，从而排除 MarkerA 异位表达的影响。

案例1
以 c-kit 基因为例，既往研究报道 c-kit+细胞是心肌细胞祖细胞（ECs），可能有助于心脏损伤后的新心肌细胞生成。然而，随后的研究表明，c-kit基因也在极少数心肌细胞中表达，表明心脏损伤后追踪的心肌细胞可能是先前标记的c-kit+心肌细胞。

但我们需要特异性靶向的c-kit+非心肌细胞，追踪其分化命运，才能得出正确的结论。因此，我们可以使用心肌细胞特异性标记工具Tnni3-Dre将心肌细胞进行标记，之后再对c-kit+细胞进行标记，此时标记的细胞即为c-kit+非心肌细胞。

图.独家报告基因系统^[2]
 

图.使用普通方法标记C-Kit⁺细胞无法准确标记ECs^[2]
 

点击下图，观看标记图示

图.使用独家报告基因系统先将心肌细胞标记为红色，后将ECs标记为绿色^[2]

上述讲述的是多重组酶报告基因系统的独家报告基因类型，主要用于标记 A⁺B^-（反之亦然）的细胞类型，这种标记存在先后顺序，相反的先后顺序会极大的影响后续的标记结果。为了更加合理的控制标记细胞类型，建议两个重组酶中一种采用可诱导类型的重组酶，从而合理控制重组发生的先后顺序。

但如果您想标记的细胞类型，他在胚胎发育期 markerA 表达，但在成年后 markerA 不表达，并且表达markerB。若我们采用独家报告基因系统，使用A-Cre与B-DreERT2，目的细胞仍无法成功标记。

是否存在可以使用两个重组酶均是可诱导型的（可控制重组发生的时间），并且两者之间的重组不会相互干扰，而且还可以成功标记 A⁺B^- 的细胞类型的报告工具鼠呢？

下一期鼠博士为大家讲解多重组酶报告基因系统的嵌套报告基因类型。

Reference：
[1] He L, Li Y, Li Y, Pu W, Huang X, Tian X, Wang Y, Zhang H, Liu Q, Zhang L, Zhao H, Tang J, Ji H, Cai D, Han Z, Han Z, Nie Y, Hu S, Wang QD, Sun R, Fei J, Wang F, Chen T, Yan Y, Huang H, Pu WT, Zhou B. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases. Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498. doi: 10.1038/nm.4437. Epub 2017 Nov 13. PMID: 29131159; PMCID: PMC6913096.

[2] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapping studies. J Biol Chem. 2020 May 8;295(19):6413-6424. doi: 10.1074/jbc.REV120.011631. Epub 2020 Mar 25. PMID: 32213599; PMCID: PMC7212637.

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