本文概述了共聚焦显微镜中常用的重要检测器。“共聚焦显微镜”在此特指“真共聚焦扫描”，即仅对单点进行激发和测量的技术。本文旨在为用户提供不同技术之间清晰的概览，并针对不同应用场景给出合适的检测器选择建议，而非深入探讨专业细节。

雪崩光电二极管
当然，目前也已经利用半导体技术制造出了可用于测量光强的光敏元件。其中，最容易与光电倍增管进行比较的器件是雪崩光电二极管（APD）。

将光子转化为电荷对   
利用半导体测量光强时，使用的是内光电效应。该效应是指光子被吸收后，在弱掺杂的半导体材料中产生一对电荷（自由电子和可扩散的“空穴”）。吸收层嵌入在p型和n型掺杂层之间，其作用类似于扩大了直接pn结处形成的耗尽区。该层被称为“i”层，因为它只表现出本征导电性。由于各层的排列顺序，这些半导体系统被称为pin二极管。如果在此类光电二极管的电极上施加反向偏置电压，则会产生与入射光强度在很大范围内成正比的电流。然而，这种二极管对于弱信号的灵敏度不够高，且噪声较大。

图13：在雪崩光电二极管中，本征（i）层夹在外部的p型和n型掺杂层之间。光子在此处被吸收并触发电荷对的产生。为简单起见，此处仅图示了一个电荷。施加的电场将该电荷移动到倍增区（右侧的pn结）。在此处，会产生大量新的电荷对，从而可以在输出端测量到一个脉冲。

雪崩效应   
为了能够测量更微弱的信号，在pin结构中增加了一个额外的层：在i层和n层之间插入另一个高掺杂的p层。此处形成的极高电场强度使电荷迅速加速，并在撞击晶格原子时释放能量，从而产生更多的电荷（这也是将其与PMT进行比较的原因）。这些新产生的电荷也会被加速，使这一过程像雪崩一样迅速扩展，并在测量电路中产生一个脉冲。如果产生的电荷量适中，雪崩过程会自动停止，增益可达10²。在极高的反向电压下，可以获得极高的增益（高达10⁸），但为了避免器件损坏，必须主动中断电流。后一种情况被称为“盖革模式”，因为它适用于无需额外放大即可检测单个光子。盖革模式的缺点是在一次测量事件后存在较长的死区时间。因此，通常这种模式不适合用于图像记录。  
它与光电倍增管（PMT）的不同之处   
与光电倍增管不同，雪崩光电二极管的动态范围较小，因此需要始终注意被测光的强度不宜过高。在非盖革模式下，其增益在100倍到1000倍之间，具体取决于施加的电压。另一方面，这种类型的检测器具有极低的暗电流，使其非常适合检测微弱信号，否则这些信号在高暗电流的背景噪声中会被淹没。其光谱灵敏度覆盖了从300纳米到超过1000纳米的宽广范围，这也解释了为什么APD也常用于特别是红色荧光发射的图像记录。尽管在红色波段具有极高的灵敏度，但其热噪声仍然相对较小。这种噪声取决于检测器的表面积，APD的表面积最大为0.1平方毫米，而PMT检测器的表面积可达10平方毫米。
APD产生非常窄的脉冲，这是光子计数的一个重要特性。然而，这一特性只能在非盖革模式下利用，因为在盖革模式下，由于极长的死区时间（几十纳秒），这一优势会丧失。

混合探测器   
如果能够将PMT的高动态范围与APD的速度和低噪声结合起来，那将是非常理想的。而混合探测器（HyD；也称为HPD：混合光电探测器或HPMT：混合光电倍增管）正是通过结合真空管和半导体组件的嵌合技术实现了这一点。 该组件中两种技术的结合确实产生了一种兼具PMT和APD最佳特性的检测器。

设计   
HyD的“输入”部分与PMT完全相同：真空管中的光电阴极通过吸收光子释放光电子。通常使用GaAsP光电阴极——这也是生物医学荧光应用中使用的PMT最合适的阴极类型。然而，与PMT不同的是，HyD中的光电子不是分阶段加速的，而是在一个单一步骤中经过超过8000伏特的电位差进行大幅加速。
由此可见，相对脉冲高度的差异远小于PMT，后者到第一倍增极的加速电压约为100伏。正如“光电倍增管”一章所述，第一倍增极释放的电子数量在2到4个之间，预期方差为1到2个电子。这就是为什么PMT的脉冲高度通常变化3到5倍的原因。相比之下，混合探测器中的光电子被8千伏的电压加速，从动能转换中获得约1500个次级电子。因此，变化约为40个电子（√1500）。虽然这肯定比2到4个电子要多，但仅占1500的3%。因此，输出脉冲非常均匀，能够更准确地反映激发能量。
图14：混合探测器（HyD）的设计。与光电倍增管类似，光子（hν）在光电阴极处被吸收并产生一个自由电子（e–）。该电子在真空中以极高的电压（约8千伏）加速。其能量在半导体材料中转换为电荷对，并在倍增层（pn）中再次放大。

图14：混合探测器（HyD）的设计。与光电倍增管类似，光子（hν）在光电阴极处被吸收并产生一个自由电子（e–）。该电子在真空中以极高的电压（约8千伏）加速。其能量在半导体材料中转换为电荷对，并在倍增层（pn）中再次放大。

使用 HyD 进行数据记录   
由于单步加速和随后的直接放大，电荷的轨迹变化要小得多，这意味着HyD产生的脉冲比PMT产生的脉冲更加锐利：脉冲宽度减少了约20倍，约为1纳秒（目前已接近½纳秒）。
此外，由于没有倍增极以及光电阴极的尺寸小得多，暗事件也大大减少。与光电倍增管相比，背景噪声也显著降低。除了提高记录图像的对比度之外，这还允许对更多图像进行平均或累积。由于背景几乎完全是黑色的，因此当大量图像合并成一个图像时，背景仍然保持黑色，这使得在高对比度下显著降低信号噪声成为可能。 因此，混合探测器具有诸多优势。其均匀且窄的脉冲允许在光电流强度下进行光子计数，而这种光电流强度很快就会使PMT过饱和。
因此，即使是对于“普通”的图像记录，也应该考虑使用处于光子计数模式的混合探测器。毕竟，正如“光子计数”一章所述，与模拟检测技术相比，光子计数具有许多优势。
图15：与图7、10和11中描述的事件过程相同，但此处使用的是混合探测器，相比普通PMT，它具有更高的带宽和更恒定的脉冲高度。显著提高的脉冲分辨率使得能够分辨间隔更紧密的脉冲（即在光子计数模式下可以记录更高的光强度）。此外，也不会遗漏小的脉冲。

因此，评估结果不会产生被噪声“污损”的直方图和准连续的直方图，而是如预期的那样，产生定义清晰的、仅包含少量光子的频率分布。图9展示的就是这样一种直方图。顶部显示的是每个像素平均10个光子的泊松分布。
利用混合探测器，徕卡TCS SP8系统提供了三种不同的数据记录技术供用户自由选择。首先，可以将光子计数的原始数据直接用作图像信息（“光子计数”模式）。由于该模式不使用线性化方法，因此最大计数率低于线性化数据，但仍然显著高于传统光电倍增管。获得的速率约为60 Mcps（兆计数/秒）（详见“光子计数”章节）。
如果通过上述的数学线性化方法对计数事件进行校正，最大计数率将提高5倍，可以记录高达300 Mcps的亮度。在这种情况下，光子可以转换为不一定是整数的值，因此最好立即进行缩放处理，以使亮度值与传统检测器具有可比性，并适合在显示器上进行平衡显示。该方法是标准应用的方法。请注意，由于展宽和舍入效应，直方图可能看起来“奇怪”。但是，在评估图像亮度时测量的数据仍然是正确的。
为了更好地呈现所使用的总动态范围，还可以对数值进行调整，以减少明亮像素的影响并增加黑暗像素的影响。这类似于HDR渲染的效果。这种模式被称为“Bright R”，用于显示亮度差异很大的图像，以避免明亮区域出现眩光，并使黑暗区域保持可见。例如，细胞体中含有大量染料而树突非常细的神经元就属于这种情况。


参考文献：
[1] Becquerel AE: Mémoire sur les effets électriques produits sous l’influence des rayons solaires. Comptes Rendus 9: 561–67 (1839).
[2] Hertz HR: Ueber den Einfluss des ultravioletten Lichtes auf die electrische Entladung. Annalen der Physik 267 (8): 983–1000 (1887).
[3] Hallwachs WLF: Ueber die Electrisierung von Metallplatten durch Bestrahlung mit electrischem Licht. Annalen der Physik 34: 731–34 (1888).
[4] Einstein A: Ueber einen die Erzeugung und Verwandlung des Lichtes betreffenden heuristischen Gesichtspunkt. Annalen der Physik 322 (6): 132–48 (1905).
[5] Newton I: Opticks. Or, A Treatise of the Reflections, Refractions, Inflections and Colours of Light (1704).
[6] Planck M: Ueber irreversible Strahlungsvorgänge. Ann. Phys, 1:  69–122 (1900).
[7] Hamamatsu Photonics KK: Photomultiplier Tubes – Basics and Applications. Ed. 3a: 310 (2007).

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