一种整合DDA-PRM-dMRM的新方案实现高风险HCPs的定性定量分析
2025-08-06 来源:本站 点击次数:80
宿主细胞蛋白（HCPs）是生物治疗药物中与工艺相关的关键杂质，会影响药物的稳定性和安全性。治疗性蛋白与残留HCPs成分的动态范围极大，往往大于5个数量级，导致高风险HCPs检测更加困难。LC-MS/MS检测可以突破传统免疫分析方法在灵敏度和特异性方面的局限性，已成为有效检测和定量HCPs的关键工具，可指导下游纯化工艺并监测HCPs清除效果。
2025年6月，中国医学科学院北京协和医学院的张金兰教授课题组在Journal of Proteome Research发表了一套新的HCPs监测方法[1]，首先通过数据依赖采集（DDA）构建包含所有潜在HCPs的CHO细胞蛋白库，然后对38种已报道的高风险HCPs进行了平行反应监测（PRM）和多重反应监测（MRM）交叉验证，最终筛选出28种高风险HCPs及其特异性肽段和离子对信息。下一步建立并验证了一种新的动态MRM（dMRM）方法，可以同时定量28种高风险HCPs。最后，应用上述策略分析了五个纯化的单克隆抗体制备工艺样品，通过DDA方法对未知HCPs进行全面分析，使用dMRM方法对28种已知高风险HCPs进行快速定量。总体而言，该策略能够对已知和未知HCPs进行全面分析，指导生物制药工艺的优化。本研究中DDA数据分析使用PEAKS Studio完成。
潜在宿主细胞蛋白库构建
许多研究倾向基于数据非依赖采集（DIA）的方法来检测HCPs，这样可以减少低丰度信号的缺失，提高蛋白质组的覆盖深度，但DIA的谱图处理更加复杂，也容易受到复杂基质的信号干扰。本研究中，作者选择了以DDA的方式构建HCPs蛋白质谱图库，基于该库直接生成PRM/MRM离子对列表，可确保工艺开发阶段方法的一致性。为确保对低丰度HCPs鉴定的全面性，作者对中国仓鼠卵巢（CHO）细胞提取的全蛋白溶液，采用了两种不同的酶切方案：自制溶液和EasyPep MS试剂盒。结果显示，EasyPep MS试剂盒处理的样本蛋白鉴定更多。最终采用EasyPep MS试剂盒、400ng质谱进样和150min梯度的方法进行后续实验（Figure S1）。最终构建了一个包含6863个蛋白质、143166条多肽的谱图库，超过了目前已报道的CHO细胞蛋白库。
高风险HCPs预测及验证
在上述已建立的谱图库基础上，作者又整合了NIST CHO多肽谱图库，然后利用整合后的谱图库，在已报道的38种高风险HCPs中，预测出了36种蛋白的444 peptides、5787 precursors和3522 transitions。通过PRM和MRM对这36种蛋白的特异性肽段进行了交叉验证，有效消除了背景和非特异性肽段的干扰，排除了在MRM和PRM数据中谱峰均较差的8个蛋白，最终验证了28种高风险HCPs的47条unique peptides和141个 transitions（Table 2）。Figure 2展示了六类高风险HCPs中代表性肽段的b/y离子碎裂谱图、PRM和MRM色谱图。这些transitions在PRM模式下具有高特异性，在MRM模式下具有出色的灵敏度和重现性，确保了定量的可靠性。
方法验证
在生物制药下游生产中，去除残留的HCPs对产品质量至关重要。大多数单克隆抗体（mAb）生产工艺需要将杂质降低至100ppm以下，不过某些具有免疫原性或生物活性的HCPs在低于这个标准的情况下仍然影响产品的安全性和有效性。因此，作者在0.1-100nmol的范围内对标准曲线进行了验证（等同于50kDa的HCP在10g/L的mAB溶液中的含量在0.5-500ppm 之间）。首先筛选出28个高风险HCPs中响应最高的28条peptides，并使用外源性合成的同位素多肽LLIYGATNLADGVPSR*(13C615N4-R)作为内标（IS）。为了模拟实际样品状态并将干扰降至最低，选择以人血浆来源的IgG作为基质，然后配置至少6个浓度梯度绘制标准曲线，得到的相关系数R2超过0.98。结果如Table S3所示，10种肽具有良好的线性（0.1 – 100nmol/L），21种肽的定量下限低于1 nmol/L），25种肽的上限达到100 nmol/L。除了LVQAQYWHDPIK的线性范围较窄外，所有肽均涵盖了下游纯化过程中典型的HCP浓度范围。此外，作者又在实际条件下对稳定性进行了验证，包括在室温（RT）下24小时的短期稳定性、冻融稳定性（从−80°C到室温的三个冻融循环）以及在4°C下7天的长期稳定性。所有肽在相对误差（RE）和相对标准偏差（RSD）±15.0%范围内保持稳定。所有验证结果均符合中国药典对生物样品的标准，这充分证明了该方法对28种高风险宿主细胞蛋白进行精确定量的稳健性，适用于生物制药过程监测和质量控制。
方法应用
作者将上述方法应用于VEGF单克隆抗体下游纯化的5个样本，检测其中的28种已知的高风险HCPs。DDA模式在细胞培养液（HCCF）中鉴定到1533种HCPs，在纯化后的原料药中鉴定到38种（Figure 4）。此外，DDA方法鉴定出了一些未被dMRM覆盖的高风险HCP（如G3GTT2和A4URF0），为全面表征HCP提供了补充信息，并证明了其在监测未知高风险HCP方面的关键价值。蛋白A亲和层析和亲和沉淀过滤（ADF）的去除效率分别达到74%和91%，表明它们在清除HCP方面的有效性。阳离子交换层析（CEX）阶段没有显著变化。值得注意的是，一些在HCCF中未检测到的HCP在下游纯化过程中被检测到，这可能是因为基质干扰减少增强了低丰度分子的信号响应。在最终药物中，仍检测到三种低ppm水平的高风险HCPs：G3IIB1、G3I6T1和G3H8 V5。它们可能导致聚山梨酯和药物降解，甚至增加免疫原性风险。尽管这三种HCPs在蛋白A亲和层析后显著减少，但在后续步骤中其清除率趋于平稳，这揭示了当前纯化流程中的选择性局限性。
总结
该研究整合了 DDA（全面分析已知和未知HCPs）、PRM（验证特异性）和 dMRM（快速定量已知高风险 HCPs）的不同方法，实现了HCPs的全面分析，为生物制药过程中HCPs的监测提供了高效、全面的解决方案，助力优化纯化工艺、提升药物质量可控性，符合QbD理念。但目前仅基于 CHO-K1 细胞系，可能无法覆盖其他 CHO 亚型或变异株的 HCPs，未来可扩展至其他宿主细胞系或微生物表达系统，结合人工智能和深度学习，扩展低丰度 HCPs的特征谱图数据，建立HCP谱图库共享平台。
文献
1. A Novel Strategy to Rapidly Profile and Quantify High-Risk Host Cell Proteins Using Integrated DDA-PRM-dMRM Mode. Xuan Xu, Lan Wang, Gang Wu, Shengyuan Xu, Yang Li, Ning Sheng, and Jinlan Zhang Journal of Proteome Research 2025 24 (8), 4259-4269, DOI: 10.1021/acs.jproteome.5c00369
作为生物信息学的领军企业，BSI专注于蛋白质组学和生物药领域，通过机器学习和先进算法提供世界领先的质谱数据分析软件和蛋白质组学服务解决方案，以推进生物学研究和药物发现。我们通过基于AI的计算方案，为您提供对蛋白质组学、基因组学和医学的卓越洞见。旗下著名的PEAKS®️系列软件在全世界拥有数千家学术和工业用户，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，DeepImmu®️ 免疫肽组发现服务和抗体综合表征服务等。联系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
2025年6月，中国医学科学院北京协和医学院的张金兰教授课题组在Journal of Proteome Research发表了一套新的HCPs监测方法[1]，首先通过数据依赖采集（DDA）构建包含所有潜在HCPs的CHO细胞蛋白库，然后对38种已报道的高风险HCPs进行了平行反应监测（PRM）和多重反应监测（MRM）交叉验证，最终筛选出28种高风险HCPs及其特异性肽段和离子对信息。下一步建立并验证了一种新的动态MRM（dMRM）方法，可以同时定量28种高风险HCPs。最后，应用上述策略分析了五个纯化的单克隆抗体制备工艺样品，通过DDA方法对未知HCPs进行全面分析，使用dMRM方法对28种已知高风险HCPs进行快速定量。总体而言，该策略能够对已知和未知HCPs进行全面分析，指导生物制药工艺的优化。本研究中DDA数据分析使用PEAKS Studio完成。
潜在宿主细胞蛋白库构建
许多研究倾向基于数据非依赖采集（DIA）的方法来检测HCPs，这样可以减少低丰度信号的缺失，提高蛋白质组的覆盖深度，但DIA的谱图处理更加复杂，也容易受到复杂基质的信号干扰。本研究中，作者选择了以DDA的方式构建HCPs蛋白质谱图库，基于该库直接生成PRM/MRM离子对列表，可确保工艺开发阶段方法的一致性。为确保对低丰度HCPs鉴定的全面性，作者对中国仓鼠卵巢（CHO）细胞提取的全蛋白溶液，采用了两种不同的酶切方案：自制溶液和EasyPep MS试剂盒。结果显示，EasyPep MS试剂盒处理的样本蛋白鉴定更多。最终采用EasyPep MS试剂盒、400ng质谱进样和150min梯度的方法进行后续实验（Figure S1）。最终构建了一个包含6863个蛋白质、143166条多肽的谱图库，超过了目前已报道的CHO细胞蛋白库。
高风险HCPs预测及验证
在上述已建立的谱图库基础上，作者又整合了NIST CHO多肽谱图库，然后利用整合后的谱图库，在已报道的38种高风险HCPs中，预测出了36种蛋白的444 peptides、5787 precursors和3522 transitions。通过PRM和MRM对这36种蛋白的特异性肽段进行了交叉验证，有效消除了背景和非特异性肽段的干扰，排除了在MRM和PRM数据中谱峰均较差的8个蛋白，最终验证了28种高风险HCPs的47条unique peptides和141个 transitions（Table 2）。Figure 2展示了六类高风险HCPs中代表性肽段的b/y离子碎裂谱图、PRM和MRM色谱图。这些transitions在PRM模式下具有高特异性，在MRM模式下具有出色的灵敏度和重现性，确保了定量的可靠性。
方法验证
在生物制药下游生产中，去除残留的HCPs对产品质量至关重要。大多数单克隆抗体（mAb）生产工艺需要将杂质降低至100ppm以下，不过某些具有免疫原性或生物活性的HCPs在低于这个标准的情况下仍然影响产品的安全性和有效性。因此，作者在0.1-100nmol的范围内对标准曲线进行了验证（等同于50kDa的HCP在10g/L的mAB溶液中的含量在0.5-500ppm 之间）。首先筛选出28个高风险HCPs中响应最高的28条peptides，并使用外源性合成的同位素多肽LLIYGATNLADGVPSR*(13C615N4-R)作为内标（IS）。为了模拟实际样品状态并将干扰降至最低，选择以人血浆来源的IgG作为基质，然后配置至少6个浓度梯度绘制标准曲线，得到的相关系数R2超过0.98。结果如Table S3所示，10种肽具有良好的线性（0.1 – 100nmol/L），21种肽的定量下限低于1 nmol/L），25种肽的上限达到100 nmol/L。除了LVQAQYWHDPIK的线性范围较窄外，所有肽均涵盖了下游纯化过程中典型的HCP浓度范围。此外，作者又在实际条件下对稳定性进行了验证，包括在室温（RT）下24小时的短期稳定性、冻融稳定性（从−80°C到室温的三个冻融循环）以及在4°C下7天的长期稳定性。所有肽在相对误差（RE）和相对标准偏差（RSD）±15.0%范围内保持稳定。所有验证结果均符合中国药典对生物样品的标准，这充分证明了该方法对28种高风险宿主细胞蛋白进行精确定量的稳健性，适用于生物制药过程监测和质量控制。
方法应用
作者将上述方法应用于VEGF单克隆抗体下游纯化的5个样本，检测其中的28种已知的高风险HCPs。DDA模式在细胞培养液（HCCF）中鉴定到1533种HCPs，在纯化后的原料药中鉴定到38种（Figure 4）。此外，DDA方法鉴定出了一些未被dMRM覆盖的高风险HCP（如G3GTT2和A4URF0），为全面表征HCP提供了补充信息，并证明了其在监测未知高风险HCP方面的关键价值。蛋白A亲和层析和亲和沉淀过滤（ADF）的去除效率分别达到74%和91%，表明它们在清除HCP方面的有效性。阳离子交换层析（CEX）阶段没有显著变化。值得注意的是，一些在HCCF中未检测到的HCP在下游纯化过程中被检测到，这可能是因为基质干扰减少增强了低丰度分子的信号响应。在最终药物中，仍检测到三种低ppm水平的高风险HCPs：G3IIB1、G3I6T1和G3H8 V5。它们可能导致聚山梨酯和药物降解，甚至增加免疫原性风险。尽管这三种HCPs在蛋白A亲和层析后显著减少，但在后续步骤中其清除率趋于平稳，这揭示了当前纯化流程中的选择性局限性。
总结
该研究整合了 DDA（全面分析已知和未知HCPs）、PRM（验证特异性）和 dMRM（快速定量已知高风险 HCPs）的不同方法，实现了HCPs的全面分析，为生物制药过程中HCPs的监测提供了高效、全面的解决方案，助力优化纯化工艺、提升药物质量可控性，符合QbD理念。但目前仅基于 CHO-K1 细胞系，可能无法覆盖其他 CHO 亚型或变异株的 HCPs，未来可扩展至其他宿主细胞系或微生物表达系统，结合人工智能和深度学习，扩展低丰度 HCPs的特征谱图数据，建立HCP谱图库共享平台。
文献
1. A Novel Strategy to Rapidly Profile and Quantify High-Risk Host Cell Proteins Using Integrated DDA-PRM-dMRM Mode. Xuan Xu, Lan Wang, Gang Wu, Shengyuan Xu, Yang Li, Ning Sheng, and Jinlan Zhang Journal of Proteome Research 2025 24 (8), 4259-4269, DOI: 10.1021/acs.jproteome.5c00369
作为生物信息学的领军企业，BSI专注于蛋白质组学和生物药领域，通过机器学习和先进算法提供世界领先的质谱数据分析软件和蛋白质组学服务解决方案，以推进生物学研究和药物发现。我们通过基于AI的计算方案，为您提供对蛋白质组学、基因组学和医学的卓越洞见。旗下著名的PEAKS®️系列软件在全世界拥有数千家学术和工业用户，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，DeepImmu®️ 免疫肽组发现服务和抗体综合表征服务等。联系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
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