蛋白质组学基础：定量方法及原理
2025-10-29 来源:本站 点击次数:23
定量蛋白质组学旨在对生物体、组织、细胞等样本中的蛋白质进行定量分析，研究其在不同生理病理状态、不同发育阶段或不同环境条件下的表达水平变化，以深入了解蛋白质功能、揭示生命活动规律和疾病发生发展机制。基于质谱的蛋白质组学定量目前已成为主流方法，在标志物发现和验证研究中发挥重要作用。本期推送我们就来为大家介绍一下常用的几种定量方法。
质谱蛋白质组定量方法可分为非标记定量、标记定量和靶向定量三个大类。非标记定量包括 DDA和DIA，前者依据一级质谱峰面积定量，但低丰度蛋白易漏检；后者对选定质荷比范围内的所有离子同时碎裂和扫描，并且基于MS2完成定性和定量，更准确、重现性更好。标记定量包括基于 MS2/MS3 报告离子定量的 TMT和iTRAQ，可同时标记多个样本，还有基于MS1代谢标记定量的 SILAC，仅适用于体外培养细胞样本。前述定量方法均用来在复杂样本的全蛋白组中筛选潜在差异表达蛋白，而靶向定量的MRM和PRM 则针对特定蛋白质或肽段进行扫描和定量分析，特异性强、准确性高，适用于后期标志物验证。
01.非标记定量
DDA和DIA都属于非标记定量(LFQ)，无需对蛋白质进行额外标记，主要依据质谱检测到的信号强度或峰面积来推断蛋白质含量。该方法实验操作相对简便，能避免标记过程引入的偏差，不受标记数量的限制，适用于大规模蛋白质组学研究，但容易受到质谱分析过程中的各种因素影响，需做好严格的质控。
图1 DDA和DIA采集原理示意[1]
1.1 DDA(数据依赖型采集）
DDA是最常用的非标记定量方法之一，主要通过比较不同样本中相同蛋白质的一级质谱峰强度或峰面积来实现。PEAKS软件的DDA LFQ定量是基于肽段特征峰(Peptide feature)面积的，feature指的是同一肽段的所有同位素峰(图2)。通过对比不同样本间定量值的高低判定其相对含量(图3)。蛋白定量值默认使用打分top 3的unique肽段定量值加和，在某些样本中的定量值高则表明在该样本中的表达量相对较高。
图2 peptide feature示例
图3 同一肽段在不同样本间的特征峰分布
DDA的实验和数据分析相对比较容易，并且适合未知的翻译后修饰和潜在突变位点分析，成本低，不过也存在一定局限性。由于其是基于信号强度选择母离子进行二级碎裂，低丰度肽段的母离子可能因信号响应过低而无法被选中，导致定量缺失，影响蛋白质定量的准确性和重现性。
1.2 DIA(数据非依赖型采集)
DIA技术是为克服DDA的局限性而发展起来的。在DIA扫描模式下，仪器不再选择性地对特定离子进行碎裂，而是对选定质荷比范围内的所有离子同时进行碎裂和扫描。常规DIA方法是将整个质谱扫描范围划分为多个连续的窗口，依次对每个窗口内的离子进行碎裂和MS2扫描，获得所有离子的二级谱。DIA的优势在于能够无遗漏、无偏差地检测样本中的所有离子，定性和定量均基于二级谱完成，蛋白定量不是简单的肽段定量值的加和，而是采用最小二乘法，将所有肽段纳入计算（图4）。
图4 DIA定量逻辑[2]
DIA比DDA定量结果更准确、重复性更好，尤其适用于复杂样本的深度蛋白质组定性和定量分析。但DIA数据的谱图极为复杂，因此对分析软件和算法的要求也就更高。PEAKS Studio和PEAKS Online支持DIA数据的定性和定量分析，并且全面兼容谱图库搜索(spectral library)、直接数据库搜索(DIA database search)和DIA de novo，根据分析需求直接选择相应的分析工作流即可(图5)。
图5 PEAKS中的DIA数据分析工作流
图6 报告离子定量示意
报告离子定量技术的优点是能够同时对多个样本(TMT最多可同时标记18个样本，iTRAQ通常可标记4-8个样本)进行定量分析，通量高，灵敏度也较好。然而，标记过程较为繁琐，成本相对较高。
2.2 基于MS1的代谢标记定量
稳定同位素标记氨基酸在细胞培养中的应用(SILAC)是典型的基于MS1的代谢标记定量方法。在细胞培养过程中，向培养基中添加含有稳定同位素(如13C、15N等)标记的必需氨基酸(如精氨酸、赖氨酸)。细胞在生长代谢过程中，会将这些标记的氨基酸整合到新合成的蛋白质中。经过多代培养后，细胞内新合成的蛋白质几乎都被稳定同位素标记。将标记细胞与未标记细胞(对照组)的蛋白质提取物混合，进行质谱分析。在MS1扫描时，由于标记和未标记蛋白质含有不同质量的氨基酸，它们的质荷比会出现差异，形成具有特定质量差的峰对。通过比较这些峰对的强度，就可以准确计算出标记样本和未标记样本中蛋白质的相对含量(图7)。
图7 SILAC定量示意
SILAC的优势在于标记过程在细胞培养阶段完成，标记均匀且对蛋白质的后续处理影响较小，定量准确性高。但该方法标记通道有限，仅适用于能够在体外培养的细胞样本，对于组织样本或难以培养的细胞则无法使用，应用范围存在一定限制，标记周期长，试剂成本也有所增加。
03.靶向定量
质谱蛋白质组定量方法可分为非标记定量、标记定量和靶向定量三个大类。非标记定量包括 DDA和DIA，前者依据一级质谱峰面积定量，但低丰度蛋白易漏检；后者对选定质荷比范围内的所有离子同时碎裂和扫描，并且基于MS2完成定性和定量，更准确、重现性更好。标记定量包括基于 MS2/MS3 报告离子定量的 TMT和iTRAQ，可同时标记多个样本，还有基于MS1代谢标记定量的 SILAC，仅适用于体外培养细胞样本。前述定量方法均用来在复杂样本的全蛋白组中筛选潜在差异表达蛋白，而靶向定量的MRM和PRM 则针对特定蛋白质或肽段进行扫描和定量分析，特异性强、准确性高，适用于后期标志物验证。
01.非标记定量
DDA和DIA都属于非标记定量(LFQ)，无需对蛋白质进行额外标记，主要依据质谱检测到的信号强度或峰面积来推断蛋白质含量。该方法实验操作相对简便，能避免标记过程引入的偏差，不受标记数量的限制，适用于大规模蛋白质组学研究，但容易受到质谱分析过程中的各种因素影响，需做好严格的质控。
图1 DDA和DIA采集原理示意[1]
1.1 DDA(数据依赖型采集）
DDA是最常用的非标记定量方法之一，主要通过比较不同样本中相同蛋白质的一级质谱峰强度或峰面积来实现。PEAKS软件的DDA LFQ定量是基于肽段特征峰(Peptide feature)面积的，feature指的是同一肽段的所有同位素峰(图2)。通过对比不同样本间定量值的高低判定其相对含量(图3)。蛋白定量值默认使用打分top 3的unique肽段定量值加和，在某些样本中的定量值高则表明在该样本中的表达量相对较高。
图2 peptide feature示例图3 同一肽段在不同样本间的特征峰分布DDA的实验和数据分析相对比较容易，并且适合未知的翻译后修饰和潜在突变位点分析，成本低，不过也存在一定局限性。由于其是基于信号强度选择母离子进行二级碎裂，低丰度肽段的母离子可能因信号响应过低而无法被选中，导致定量缺失，影响蛋白质定量的准确性和重现性。
1.2 DIA(数据非依赖型采集)
DIA技术是为克服DDA的局限性而发展起来的。在DIA扫描模式下，仪器不再选择性地对特定离子进行碎裂，而是对选定质荷比范围内的所有离子同时进行碎裂和扫描。常规DIA方法是将整个质谱扫描范围划分为多个连续的窗口，依次对每个窗口内的离子进行碎裂和MS2扫描，获得所有离子的二级谱。DIA的优势在于能够无遗漏、无偏差地检测样本中的所有离子，定性和定量均基于二级谱完成，蛋白定量不是简单的肽段定量值的加和，而是采用最小二乘法，将所有肽段纳入计算（图4）。
图4 DIA定量逻辑[2]
DIA比DDA定量结果更准确、重复性更好，尤其适用于复杂样本的深度蛋白质组定性和定量分析。但DIA数据的谱图极为复杂，因此对分析软件和算法的要求也就更高。PEAKS Studio和PEAKS Online支持DIA数据的定性和定量分析，并且全面兼容谱图库搜索(spectral library)、直接数据库搜索(DIA database search)和DIA de novo，根据分析需求直接选择相应的分析工作流即可(图5)。
图5 PEAKS中的DIA数据分析工作流
02.标记定量
标记定量是通过对蛋白质或肽段进行化学标记，使不同样本中的蛋白质带有可区分的标记物，从而在质谱检测时更精准地进行定量分析。该方法能有效提高定量的准确性和灵敏度，减少样本间的误差。
2.1 基于MS2/MS3的报告离子定量
常用的基于MS2/MS3报告离子定量技术有TMT和iTRAQ。TMT和iTRAQ试剂均由报告基团、平衡基团和反应基团组成。反应基团可与蛋白质或肽段的特定基团(如赖氨酸残基的氨基)发生共价结合，实现标记。标记后的不同样本混合进行质谱分析。在MS1扫描时，由于标记后的肽段带有相同质量的标签，所以具有相同的质荷比，无法区分不同样本来源的肽段。但在MS2扫描时，肽段发生碎裂，报告基团从标签上脱落，产生具有特征质量的报告离子。不同样本的报告离子质量不同，通过检测这些报告离子的强度，就能计算出不同样本中相应蛋白质的相对含量(图6)。部分情况下，还可以进行TMT MS3扫描，进一步提高定量的准确性，减少干扰。
标记定量是通过对蛋白质或肽段进行化学标记，使不同样本中的蛋白质带有可区分的标记物，从而在质谱检测时更精准地进行定量分析。该方法能有效提高定量的准确性和灵敏度，减少样本间的误差。
2.1 基于MS2/MS3的报告离子定量
常用的基于MS2/MS3报告离子定量技术有TMT和iTRAQ。TMT和iTRAQ试剂均由报告基团、平衡基团和反应基团组成。反应基团可与蛋白质或肽段的特定基团(如赖氨酸残基的氨基)发生共价结合，实现标记。标记后的不同样本混合进行质谱分析。在MS1扫描时，由于标记后的肽段带有相同质量的标签，所以具有相同的质荷比，无法区分不同样本来源的肽段。但在MS2扫描时，肽段发生碎裂，报告基团从标签上脱落，产生具有特征质量的报告离子。不同样本的报告离子质量不同，通过检测这些报告离子的强度，就能计算出不同样本中相应蛋白质的相对含量(图6)。部分情况下，还可以进行TMT MS3扫描，进一步提高定量的准确性，减少干扰。
图6 报告离子定量示意
报告离子定量技术的优点是能够同时对多个样本(TMT最多可同时标记18个样本，iTRAQ通常可标记4-8个样本)进行定量分析，通量高，灵敏度也较好。然而，标记过程较为繁琐，成本相对较高。
2.2 基于MS1的代谢标记定量
稳定同位素标记氨基酸在细胞培养中的应用(SILAC)是典型的基于MS1的代谢标记定量方法。在细胞培养过程中，向培养基中添加含有稳定同位素(如13C、15N等)标记的必需氨基酸(如精氨酸、赖氨酸)。细胞在生长代谢过程中，会将这些标记的氨基酸整合到新合成的蛋白质中。经过多代培养后，细胞内新合成的蛋白质几乎都被稳定同位素标记。将标记细胞与未标记细胞(对照组)的蛋白质提取物混合，进行质谱分析。在MS1扫描时，由于标记和未标记蛋白质含有不同质量的氨基酸，它们的质荷比会出现差异，形成具有特定质量差的峰对。通过比较这些峰对的强度，就可以准确计算出标记样本和未标记样本中蛋白质的相对含量(图7)。
图7 SILAC定量示意
SILAC的优势在于标记过程在细胞培养阶段完成，标记均匀且对蛋白质的后续处理影响较小，定量准确性高。但该方法标记通道有限，仅适用于能够在体外培养的细胞样本，对于组织样本或难以培养的细胞则无法使用，应用范围存在一定限制，标记周期长，试剂成本也有所增加。
03.靶向定量
靶向定量是对预先设定的特定母离子进行定量分析，具有高灵敏度、高特异性和准确性的特点，是蛋白质组学研究中发现的潜在生物标志物验证的重要方法。如图8A所示，多重反应监测(MRM)及平行反应监测(PRM)是常用的靶向定量方法。在MRM模式下，仪器首先选择目标肽段的母离子(特定质荷比的离子)进行检测(Q1选择)，母离子在碰撞室中碎裂后，仪器再选择特定的碎片离子(Q3选择)进行监测。通过监测母离子到特定碎片离子的反应，能够特异性地检测目标肽段，排除其他干扰。PRM技术则是在MRM基础上发展而来，它利用高分辨率质谱，能够同时监测多个目标肽段的所有碎片离子，获得更全面的信息，提高定量的准确性和可靠性(图8B)。靶向定量需要预先了解目标肽段母离子的信息，如氨基酸序列、m/z等，通过针对性地优化检测条件，实现对目标肽段和蛋白的精确定量。
图8 靶向定量示意
04.参考文献
[1]. Guo J, Huan T. Comparison of Full-Scan, Data-Dependent, and Data-Independent Acquisition Modes in Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Based Untargeted Metabolomics. Anal Chem. 2020 Jun 16;92(12):8072-8080. doi: 10.1021/acs.analchem.9b05135. Epub 2020 May 27. PMID: 32401506.
[2].Cox J, Hein MY, Luber CA, Paron I, Nagaraj N, Mann M. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Mol Cell Proteomics. 2014 Sep;13(9):2513-26. doi: 10.1074/mcp.M113.031591. Epub 2014 Jun 17. PMID: 24942700; PMCID: PMC4159666.
作为生物信息学的领军企业，BSI专注于蛋白质组学和生物药领域，通过机器学习和先进算法提供世界领先的质谱数据分析软件和蛋白质组学服务解决方案，以推进生物学研究和药物发现。我们通过基于AI的计算方案，为您提供对蛋白质组学、基因组学和医学的卓越洞见。旗下著名的PEAKS®️系列软件在全世界拥有数千家学术和工业用户，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽组发现服务和抗体综合表征服务等。联系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
[1]. Guo J, Huan T. Comparison of Full-Scan, Data-Dependent, and Data-Independent Acquisition Modes in Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Based Untargeted Metabolomics. Anal Chem. 2020 Jun 16;92(12):8072-8080. doi: 10.1021/acs.analchem.9b05135. Epub 2020 May 27. PMID: 32401506.
[2].Cox J, Hein MY, Luber CA, Paron I, Nagaraj N, Mann M. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Mol Cell Proteomics. 2014 Sep;13(9):2513-26. doi: 10.1074/mcp.M113.031591. Epub 2014 Jun 17. PMID: 24942700; PMCID: PMC4159666.
作为生物信息学的领军企业，BSI专注于蛋白质组学和生物药领域，通过机器学习和先进算法提供世界领先的质谱数据分析软件和蛋白质组学服务解决方案，以推进生物学研究和药物发现。我们通过基于AI的计算方案，为您提供对蛋白质组学、基因组学和医学的卓越洞见。旗下著名的PEAKS®️系列软件在全世界拥有数千家学术和工业用户，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽组发现服务和抗体综合表征服务等。联系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
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