文献信息
中国农业大学动物科学与技术学院动物营养学国家重点实验室刘丹/呙于明团队的研究成果“Anaerostipes caccae CML199 enhances bone development and counteracts aging-induced bone loss through the butyrate-driven gut–bone axis: the chicken model”（粪厌氧棒杆菌CML199通过丁酸介导的肠-骨轴促进骨骼发育并减缓衰老引起的骨质流失：鸡模型）在学术期刊《Microbiome》（IF：13.8）上发表。本研究首次鉴定并报导了禽类的髓质骨结构特征和发育规律，平生公司的离活一体CT（NEMO）在论文中提供了重要的图像和定量分析结果。

该论文的通讯作者为刘丹副教授和呙于明教授，第一作者为吕正天老师。

文献摘要
背景：肠道微生物是骨代谢的关键调节因子。研究肠道微生物群与骨重塑之间的关系为治疗骨骼相关的疾病提供了新的途径。尽管在理解哺乳动物肠道微生物调控骨代谢方面取得了重大进展，但有关鸟类的研究仍然有限。鸟类具有独特的骨生理和解剖特征用以支持产卵。然而，肠道微生物是否以及如何影响鸟类的骨生理尚不清楚。在这项研究中，作者利用蛋鸡作为研究模型首次鉴定并报导了鸟类特有的髓质骨结构，解析了鸟类的骨骼发育模式，阐明了骨骼发育与肠道微生物之间的关系，并挖掘了一株具有骨调节作用的益生菌粪厌氧棒杆菌CML199。

结果：衰老导致蛋鸡股骨骨密度持续增加。老年蛋鸡骨髓腔内髓质骨的持续沉积导致骨小梁显著减少、骨代谢减弱。盲肠微生物组成在性成熟前后发生了显著变化，梭菌目中的一些菌属可能与产蛋母鸡的出生后骨骼发育有关。研究进一步通过无菌鸡模型和鸡原代成骨细胞评估并鉴定出了一种具有骨代谢调节作用的益生菌株粪厌氧棒杆菌CML199（Anaerostipes caccae CML199，ANA）。其益生作用与发酵产物中的丁酸有关。长达72周的长期动物实验证实，日粮添加ANA菌粉可以通过改善蛋鸡的骨髓免疫微环境进而促进蛋鸡性成熟时期的骨骼发育。在日粮中持续添加ANA菌粉50周可防止髓质骨过度沉积，同时减轻衰老引起的骨质疏松。

结论：这些发现强调了ANA对骨生理的益生作用，为家禽骨相关疾病的微生物干预提供了新的视角，并可能扩展到人类健康。

实验方法
生长发育期蛋鸡日粮中添加ANA菌粉和包被丁酸钠对蛋鸡骨骼发育的影响
选取450只1日龄的京粉6号蛋鸡，分为三个处理：饲喂基础日粮的对照组（Control）、基础日粮添加109 CFU/kg ANA冻干菌粉处理组（ANA组）和基础日粮添加1.5 g/kg包被丁酸钠处理组（CSB组），每个处理10个重复，每个重复15只鸡。在试验的两周内，ANA组的蛋鸡每隔一天接受108 CFU/mL ANA活菌灌喂（1 mL/只/天），对照组和CSB组的蛋鸡接受等量生理盐水灌喂，试验持续20周。

持续补充ANA对老龄蛋鸡骨生理的影响
在20至72周之间，将ANA组的蛋鸡按照体重平均分为两组，其中一组继续饲喂ANA菌粉（cANA组），另一组停止饲喂ANA菌粉，更换为基础日粮（sANA），每组5个重复，每个重复12只鸡。从对照组中随机挑选60只鸡，分为5个重复，每个重复12只鸡，日粮不变，试验持续至72周龄。

Micro-CT分析
使用Micro-CT（NEMO，平生医疗科技有限公司）扫描蛋鸡的股骨。为了确保后续分析的位置的一致性，股骨的最外侧被选作标志点，如图所示。对于股骨微结构扫描的区域，从蓝色标记区域下方的3 mm开始，分析共计60个切片（3 mm）。三维图像采用1024 × 1024分辨率进行可视化，图像分割采用自适应迭代阈值方法来区分皮质骨、骨小梁和髓质骨。

                                    图1 股骨扫描区域界定

实验结果
蛋鸡骨骼发育规律
依据结构差异鉴定出了皮质骨和骨小梁，依据CT值差异，鉴定出髓质骨。髓质骨在10周龄之前尚未发育形成，25周龄之后形成并随蛋鸡衰老逐渐填充骨髓腔。

性成熟之前（10-25周龄）是皮质骨迅速发育的阶段。与10周龄相比，25周龄蛋鸡的Cb. BV显著增加，直到98周龄保持稳定；72周龄蛋鸡的Cb. Th最高，其余周龄之间无显著差异；Cb. BMD随着蛋鸡周龄增加不断提高，25和45周龄蛋鸡的Cb. BMD显著高于10周龄，直至72周龄到达最高；Cb. BMC的变化趋势与Cb. BV相同，25周龄显著增加，并稳定至98周龄。

衰老会导致骨小梁结构损失，Tb. BV/TV在10-45周龄之间逐渐降低，45-98周龄之间变化不明显。Tb. Th随年龄增加不断下降，在98周龄时降至最低。Tb. BS/TV变化趋势与Tb. BV/TV类似，自生长发育期至产蛋高峰期之后不断地下降，并稳定至98周龄。自10-72周龄，Tb. BMC出现陡降，在72和98周龄降至最低。Tb. BMD在10-45周龄期间保持稳定，在45-98周龄之间不断上升。Tb. BV和Tb. BS的变化趋势相同，10-25周龄之间无显著差异，25-45周龄期间显著降低，并稳定至98周龄。Tb. Sp在10-25周龄期间显著增加，直至98周龄保持稳定。Tb. N和Conn. D的变化趋势恰好与Tb. Sp相反。Tb. Pf是衡量骨小梁连接度的一个指标，发生骨质疏松时骨小梁模式因子增加，即骨小梁从板状变为杆状，72-98周龄蛋鸡的骨小梁模式因子显著高于10、25和45周龄。蛋鸡周龄的增加也伴随着BM. CV/TV不断缩小，在72周龄和98周龄时BM. CV/TV最小。

髓质骨在25周龄之前尚未发育形成，进入产蛋高峰期之后，Mb. BV/TV随蛋鸡周龄增加不断提高，在72-98周龄期间达到最高。自25-98周龄之间，Mb. BMD不断增加，98周龄时最高。Mb. BMC同样在98周龄最高，其余周龄之间无显著差异。与25周龄蛋鸡相比，45周龄和72周龄的Mb. Th显著增加，98周龄蛋鸡的Mb. Th最高。髓质骨的存在形式有两种，在产蛋高峰期体积较小，弥散在骨小梁周围，随着周龄增加，体积逐渐增加，并逐渐形成球状，甚至填充骨髓腔）。由此造成的结果是增加整体股骨的硬度。

图2 蛋鸡股骨与年龄相关的生理变化。通过CT扫描得到的皮质骨（Cb）、骨小梁（Tb）和髓质骨（Mb）的代表性图像。B-E皮质骨体积（Cb.BV）（B）、皮质骨厚度（Cb.Th）（C）、皮质骨骨密度（Cb.BMD）（D）和皮质骨矿物质含量（Cb.BMC）（E）的量化。F-J骨小梁体积（BV）与股骨总体积比（Tb.BV/总体积[TV]）的量化（F），骨小梁厚度（Tb.Th）（G），骨小梁表面积（BS）与股骨总量比（Tb.BS/TV）（H），骨小梁矿物质含量（Tb.BMC）（I）和骨小梁骨密度（Tb.BMD）（J）。K髓腔体积与股骨总体积比的量化（BM.CV/TV）。L-N髓质骨体积与股骨总体积比（Mb.BV/TV）（L）、髓质骨骨密度（Mb.BMD）（M）和髓质骨矿物质含量（Mb.BMC）（N）的量化。 (O)成纤维细胞生长因子23（FGF23）的mRNA表达。(P)股骨碱性磷酸酶（ALP）活性的测定。(Q)股骨中抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性的测量。

Anaerostipes caccae CML199对育成期蛋鸡骨骼发育的作用

为了评估ANA或丁酸盐对蛋鸡性成熟期骨骼发育的影响，从1日龄到20周龄，在蛋鸡日粮中添加ANA冻干菌粉或包被丁酸钠（CSB）。日粮中补充ANA菌粉末显著增强了Cb.BV、Cb.Th和Cb.BMC。在骨小梁参数方面，补充ANA可改善Tb.BV/TV，Tb.BV，Tb.BMD和Tb.Th。补充CSB显著增加了Tb.BV/TV，Tb.BS/TV和Tb.BS。尽管ANA补充对髓质骨形成没有明显影响，但CSB补充增强了Mb.BV/TV。ANA和CSB处理均未表现出对Mb. BMC或Mb. BMD的调节作用。ANA和CSB均显著提高了股骨ALP活性和血清OCN水平。ANA或CSB均未改变股骨TRAP活性，而补充CSB导致CTX-I水平降低。

图6 日粮添加ANA菌粉和包被丁酸钠可促进性成熟期间的骨骼发育。对照组、ANA组和CSB组股骨皮质骨（Cb）、小梁骨（Tb）和髓质骨（Mb）的CT扫描图像。B-E皮质骨体积（Cb.BV）（B）、皮质骨厚度（Cb.Th）（C）、皮质骨矿物质含量（Cb.BMC）（D）和皮质骨密度（Cb.Th）（E）F-J骨小梁体积占比（Tb.BV/TV）（F）、骨小梁面积占比（Tb.BS/TV）（G）、骨小梁骨密度（Tb.BMD）（H）、骨小梁矿物质含量（Tb.BMC）（I）和骨小梁厚度（Tb.Th）（J）的量化。K-M髓质骨BV/TV（Mb.BV/TV）（K）、髓质骨矿物质含量（Mb.BMC）（L）和髓质骨密度（Mb.BMD）（M）的量化。N-Q股骨碱性磷酸酶（ALP）活性（N）、血清骨钙素（OCN）（O）、股骨抗酒石酸磷酸酶（TRAP）活性（P）和血清C-末端端肽-I（CTX-I）（Q）的测量。

Anaerostipes caccae CML199菌粉持续饲喂对老龄蛋鸡骨骼的作用

cANA和sANA均轻微地提高了Cb. Th并显著地降低了Cb. BMD。cANA对骨小梁有明显的保护作用，表现为Tb. BV，Tb. BV/TV，Tb. Th均显著高于对照组。sANA组的各个骨参数水平介于cANA和对照组之间。cANA组的Mb. BV/TV明显少于对照组，Mb. BMD轻微降低。在对照组内，髓质骨开始明显地转变为球状或完全填充骨髓腔。cANA组蛋鸡的股骨ALP和TRAP活性，血清OCN水平均显著高于对照组，sANA仅略微增加了股骨ALP活性。

图8 持续补充ANA菌粉可以防止衰老引起的骨质流失。对照组、cANA组（持续补充ANA菌粉）和sANA组（停止补充ANA菌粉）股骨皮质骨（Cb）、骨小梁（Tb）和髓质骨（Mb）的代表性图像。B-E皮质骨体积（Cb.BV）（B）、皮质骨厚度（Cb.Th）（C）、皮质骨骨密度（Cb.BMD）（D）和皮质骨矿物质含量（Cb.BMC）（E）的量化。F-J骨小梁BV/TV（Tb.BV/TV）的定量（F）、骨小梁BS/TV（Tb.BS/TV）（G）、骨小梁骨密度（Tb.BMD）（H）、骨小梁矿物质含量（Tb.BMC）（I）和骨小梁厚度（Tb.Th）（J）。K-M髓质骨BV/TV（K）、髓质骨密度（Mb.BMD）（L）和髓质骨矿物质含量（Mb.BMC）（M）的量化。N-Q股骨碱性磷酸酶（ALP）活性（N）、血清骨钙素（OCN）（O）、股骨抗酒石酸磷酸酶（TRAP）活性（P）和血清C-末端端肽-I（CTX-I）（Q）的测量。

使用结论
本研究阐明了蛋鸡独特的骨骼发育模式，并鉴定了一种具有骨调节作用的新型益生菌株。作者的研究结果表明，随着蛋鸡周龄的增长，骨髓腔内髓质骨的持续沉积会导致严重的骨小梁损失。盲肠菌群结构在性成熟前后发生了显著变化，梭菌属内的一些属可能与蛋鸡的骨骼发育有关。ANA通过其发酵产物中的丁酸盐促进骨形成。ANA通过改善蛋鸡骨髓的免疫微环境来促进性成熟期间的骨发育。持续50周的ANA饮食补充可防止髓质骨过度沉积，减轻衰老引起的骨小梁损失。这项研究为家禽骨相关疾病的微生物干预提供了新的视角，并可能扩展到人类健康。

使用设备

  Micro CT (型号：NEMO) (平生医疗科技)
影像软件：Avatar（平生医疗科技）