避暗实验又称"步入法"（step-through test），是由J.B. Overton和D.S. Chamberlain在20世纪60年代末期开发的行为学范式。其核心设计基于啮齿类动物作为夜行性动物的天然嗜暗特性，通过将这种先天偏好与厌恶刺激（如适度电击）相结合，形成被动回避条件反射，从而评估动物的学习记忆能力。

与主动回避范式相比，避暗实验具有应激水平相对较低、操作简便、实验周期短等优势，被广泛用于初步药物筛选和遗传学研究。特别是2020年以来，随着光遗传学、钙成像技术和深度学习行为分析的应用，避暗实验的神经机制解析度和行为评估精度显著提高。本文系统梳理了避暗实验的原理、流程与应用前沿，以期为相关领域研究者提供全面的方法学参考。

避暗实验的行为学原理基于啮齿类动物的嗜暗天性（scototaxis）与回避学习（avoidance learning）的结合。在自然状态下，小鼠和大鼠表现出对黑暗环境的明显偏好，在明暗箱中选择停留在暗室的时间通常占60%以上。这种偏好被认为是一种进化适应的生存策略，因为黑暗环境为夜行性啮齿动物提供更多保护。

实验通过在这种天性行为基础上施加厌恶刺激（暗室电击），使动物形成"暗室-电击"的关联记忆。一旦这种关联形成，动物会抑制其进入暗室的自然倾向，表现为进入暗室的潜伏期延长和错误次数减少。这种被动回避反应属于条件反射的一种形式，与主动回避（如穿梭箱）相比，它要求动物抑制某种行为而不是发起新行为。

避暗实验能够区分记忆处理的三个关键阶段：

• 记忆获得（acquisition）：训练阶段动物学习"暗室-电击"关联的过程，可通过训练前给药干扰

• 记忆巩固（consolidation）：训练后记忆从短期存储转为长期存储的过程，可通过训练后立即给药干扰

• 记忆再现（retrieval）：测试阶段动物提取和表达已存储记忆的过程，可通过测试前给药干扰

这种阶段性特征使避暗实验能够精细解析不同药物或病理条件对特定记忆过程的影响。

避暗实验中的学习记忆过程依赖于多脑区神经网络的协同工作。研究表明：

• 海马体：在空间记忆和情境记忆编码中起核心作用，特别是CA1区神经元活动与回避行为密切相关

• 前额叶皮层：尤其是背内侧前额叶皮层（dmPFC），参与恐惧记忆的提取和决策制定

• 杏仁核：在恐惧情感记忆的形成和表达中起关键作用

• 胆碱能系统：基底前脑胆碱能神经元投射至海马和皮层，调节学习记忆过程

在分子机制层面，NMDA受体、cAMP反应元件结合蛋白（CREB）和脑源性神经营养因子（BDNF）信号通路对避暗记忆的形成和存储至关重要。

现代避暗实验系统通常由以下几个核心组件构成：

• 测试箱体：分为明室和暗室两个区域，大小因动物种类而异。小鼠测试箱一般为27cm×16cm×20cm（长×宽×高），大鼠为48cm×24cm×30cm。明室通常采用白色塑料材质并设有强光照明（≥1000 lux），暗室采用黑色密闭材料。

• 电刺激系统：暗室底部设有铜栅栏，可通电流产生足部电击。小鼠推荐电流参数为0.15-0.6mA（常用0.25mA）或电压30-36V，频率5-15Hz。

• 自动监测系统：包括红外探测器、视频追踪系统和自动控制软件（如SuperPas、VisuTrack等），可自动记录潜伏期、错误次数、运动轨迹等参数。
  
  3.2 实验动物准备

• 动物选择：常用C57BL/6J品系小鼠（8-12周龄），体重20-30g。避免使用视力障碍或运动缺陷个体。

• 适应性饲养：实验前3-7天将动物移至行为实验室适应环境，维持12/12小时光暗周期，温度22-25℃。

• 习惯化处理：实验前每天对动物进行5-10分钟轻柔安抚，降低因操作引起的应激反应。

• 预筛选：正式实验前进行明暗偏好测试，剔除在暗室停留时间不足60%或潜伏期超过180秒的个体。

• 3.3 标准化实验流程

  避暗实验通常分为三个阶段进行，总周期约2-3天：

  阶段一：适应期（第1天）

• 将小鼠头朝室壁放入明室，两室之间的门洞敞开

• 阶段二：训练期（第1天，适应后1小时）

• 将小鼠放入明室，自动计时开始

• 当动物进入暗室时，关闭门洞并施加足部电击（0.3-0.5mA，持续2-3秒）

• 电击后保持暗室封闭30秒以强化记忆联系

• 记录动物电击反应：A级（剧烈嘶叫并跳跃）、B级（微弱尖叫）、C级（无叫声但跳跃）

• 阶段三：测试期（第2天，训练后24小时）

• 将小鼠再次放入明室，不施加电击

• 记录5分钟内首次进入暗室的潜伏期（最大300秒）

• 记录错误次数（进入暗室次数）和各室停留时间
  
  3.4 数据处理与分析

  关键数据分析指标包括：

• 避暗潜伏期（step-through latency, STL）：动物首次进入暗室的时间，反映记忆保持强度

• 错误次数：5分钟内进入暗室的总次数，反映记忆准确性

• 明/暗室停留时间：在各室停留的时间比例，反映空间偏好变化

• 运动路程：总运动距离，反映一般活动水平

• 统计方法采用t检验或单因素方差分析（one-way ANOVA），多组比较采用Fisher's LSD事后检验，显著性水平设为p<0.05。

  4 应用范围
  4.1 神经退行性疾病研究

  避暗实验广泛应用于阿尔茨海默病（AD）模型动物的认知功能评价。研究表明：

• APP/PS1转基因小鼠在测试期中避暗潜伏期显著缩短（45.2±12.3秒 vs 对照组112.6±28.7秒），错误次数增加2倍以上（p<0.01）

• Aβ蛋白沉积与记忆障碍严重程度呈正相关，潜伏期缩短程度可反映病理进展

• 胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐处理能显著改善AD模型小鼠的避暗表现，潜伏期延长至正常水平的80%以上

• 4.2 药理学与毒理学评价

  避暗实验常用于评估神经活性物质对认知功能的影响：

• 东莨菪碱（胆碱能拮抗剂）：训练前20分钟注射（1-3mg/kg）可使潜伏期缩短50%以上，错误次数增加2-3倍，模拟记忆获得障碍

• 乙醇（记忆再现干扰剂）：测试前15分钟灌胃（35%，0.1ml/10g）可使潜伏期从280±15秒降至92±24秒， reversibly抑制记忆提取

• 亚硝酸钠（记忆巩固干扰剂）：训练后立即注射（90mg/kg）导致30-48小时后记忆表现显著受损

• 4.3 记忆机制研究

  通过避暗实验与其他技术的结合，研究人员揭示了记忆过程的多种神经机制：

• 光遗传学研究：抑制海马CA1区神经元活动使工作记忆错误增加2.3倍，而不影响参考记忆

• 光纤记录研究：发现dmPFC-BLA（背内侧前额叶皮层-基底外侧杏仁核）通路在主动回避中激活，而dmPFC-DMS（背内侧纹状体）通路在被动回避中更活跃

• 分子生物学研究：CREB敲除小鼠显示避暗记忆巩固缺陷，而BDNF过表达小鼠表现增强的记忆保持

•  

• 让动物在明暗两室内自由探索2-3分钟

• 取出放回饲养笼，不清洗设备以保留气味线索