本文要点：在药物使用中，对多器官功能障碍进行精确且快速的监测至关重要。本文开发了一种多通道近红外二区（NIR-II）荧光生物成像方法，该方法能够实时、快速且定量地评估多器官功能障碍。同时，合成了一系列具有不同吸收和发射波长的NIR-II半花菁染料（HDs），通过修饰这些染料，实现了对肝脏、肾脏、胃和肠道的高空间和时间分辨率成像。该方法进一步应用于研究由顺铂（一种已知会导致胃排空问题以及肝肾损伤的药物）引起的疾病。通过监测这些器官中染料的代谢速率，准确量化了多器官功能障碍，并得到了金标准病理分析的证实。此外，本文还评估了五种马兜铃酸（AAs）对多器官功能障碍的影响，首次发现AA-I和AA-II可引起胃排空障碍，这一发现通过转录组学分析得到了进一步验证。本文的研究引入了一种同时监测多器官功能障碍的新方法，有望加快药物副作用的评估。

在本研究中，通过扩展共轭体系、替换杂原子以及修饰各种取代模式，创建了一系列发射波长在674至1145纳米之间的光谱可调谐的高分子量（HD）库。研究者还运用合理的分子工程，将HD3荧光团片段与肾脏清除率增强功能片段（单-(6-(1,6-己二胺)-6-脱氧)-β-环糊精）融合，制得HD3-CD，该物质同时具有肝脏和肾脏清除特性。因此研究者能够进行实时、无创的近红外二区（NIR-II）成像，以评估顺铂诱导的肝脏和肾脏功能障碍（图1A）。此外，分别研究了发射波长超过1100纳米的耐酸HD6和HD14，以评估顺铂对胃和肠道的损伤（图1B）。基于此，进一步建立了一个多通道生物成像平台，利用HD6、HD3-CD和HD14在660、808和915纳米激光下的优异光谱区分能力，对肝脏、肾脏、胃和肠道进行监测（图1C）。这种多色成像技术首次被用于鉴定由马兜铃酸I（AA-I）和马兜铃酸II（AA-II）引起的潜在胃排空障碍，并通过转录组学分析进一步证实了这一点（图1D）。

图1. 用于监测药物诱导的多器官功能障碍的多路近红外二区（NIR-II）成像平台设计

增强共轭是使发射波长红移的有效方法。基于HD的经典D-π-A结构设计了三种转换策略。首先，扩展末端部分的共轭体系引入了呋喃苯并[cd]吲哚，它将发射驱动到NIR-II窗口。其次，将杂原子（X）从氧（O）替换为硫（S）、硒（Se）和硅（Si）预计会实现更大的红移。最后，改变末端杂环中的取代模式（如羟基和乙二胺）可以进行微调，从而为NIR-II多路成像定制合适的荧光团。这一策略导致了14种光谱上不同且兼容的荧光团的开发（图2A）。所有HDs都可以通过两条稳健的路线合成：（i）将黄原烯骨架的衍生物与各种吲哚化合物结合，产生HD1-10和HD13-14。（ii）菁ET-1080与3-羟基苯硫酚或物种3缩合形成HD11-12。HD的详细合成和表征见支持信息。所有染料的纯度均大于95%。

图2. HD的物理和化学性质

在甲醇中研究了HDs的光物理性质，结果总结于图2A和支持信息图S1中。HDs的光谱覆盖了近红外一区（NIR-I）和二区（NIR-II）窗口，其最大吸收波长（λmaxabs）范围为659至988 nm，最大发射波长（λmaxem）范围为674至1145 nm，展现出良好的成像前景（图2B‒G）。与HD1（676 nm）相比，HD2（780 nm）、HD3（850 nm）、HD4（840 nm）和HD5（830 nm）的λmaxem分别红移了104、174、164和154 nm，表明扩展共轭结构是提升成像性能的有效方法。杂原子（O、S、Se、Si）的替换导致λmaxem从HD3（850 nm）到HD11（855 nm）、HD12（880 nm）和HD13（944 nm）分别红移了5、30和94 nm，表明硅取代（HD13）比硒、硫和氧更能有效促进光谱红移。然而，苯环上间位和对位羟基取代对λmaxem的影响较小。此外，基于前期经验，在HD14结构中同时引入呋喃-苯并[cd]吲哚和乙二胺部分，使其λmaxem红移至1145 nm，这是HD家族中异常长的发射波长。值得注意的是，HD13（235 nm）和HD14（157 nm）中硅原子取代产生了显著的斯托克斯位移，可有效减少激发光的干扰。

图3. 实时体内NIR-II成像

肝脏和肾脏功能障碍是药物的常见副作用。监测这些功能障碍对于防止肾毒性或肝毒性药物上市至关重要。综合考虑成像能力与结构可修饰性后，选择以HD3为基础进行改造，通过引入羧基获得HD3-CAR，最终与肾清除增强组分（单-(6-(1,6-己二胺)-6-脱氧)-β-环糊精，HeβCD）耦联制备HD3-CD。HD3-CD在水中最大吸收波长（λmaxabs）为704 nm，最大发射波长（λmaxem）为939 nm；在甲醇中λmaxabs为803 nm，λmaxem为940 nm。研究者评估了HD3-CD在肝肾功能障碍监测中的应用效果。以具有显著肾毒性的化疗药物顺铂（20 mg/kg，72小时）为模型，通过NIR-II窗口动态观测发现：顺铂处理组小鼠肾脏在HD3-CD注射后1小时和9小时的信号衰减速率（0.07±0.06和0.47±0.04）显著慢于生理盐水对照组（0.31±0.09和0.63±0.05）（图3B）；肝脏信号在5小时和9小时的清除速率（0.11±0.2和0.24±0.05）也低于对照组（0.24±0.04和0.39±0.04）（图3C），这与病理切片（图S7A-B）及血液生化指标（图3D-E）结果一致，证实HD3-CD可通过NIR-II成像无创监测顺铂引发的肝肾功能障碍。

顺铂还常引发胃肠道副作用，其强烈的胃肠毒性会降低患者的治疗积极性。研究者尝试建立比钡餐和内窥镜等主流技术更安全便捷的近红外二区（NIR-II）胃肠成像监测模式。HD6、HD7和HD8在酸性条件下能保持稳定的吸收强度。值得注意的是，HD6与HD3-CD的光谱间隔良好，为多重成像提供了基础。

图4. NIR-II多重成像

得益于HD6、HD3-CD和HD14的光谱间隔特性，基于近红外二区（NIR-II）的多器官损伤多重监测成像成为可能。这三种探针的吸收波段间隔近200 nm（图4A），可分别通过660 nm、808 nm和915 nm激光正交激发且串扰极低——离心管中有机/水溶液的成像实验显示：660 nm激发时，有机相与水相的荧光强度比分别为82.0/9.8/8.2和76.4/9.4/14.2（HD6主导）；808 nm激发时为1.5/80.5/18和2.2/66.8/31.0（HD3-CD主导）；915 nm激发时为9.2/11.9/78.9和1.7/23.6/74.7（HD14主导）（图4B）。

基于此，对顺铂/PBS处理小鼠进行双通道成像：静脉注射HD3-CD（808 nm激发，通道2）后口服HD6（660 nm激发，通道1），实现了胃肠、肝脏与肾脏的长期高对比度监测（图4C）。给药0.3小时时，PBS组与顺铂组的腹侧观胃/肝脏信噪比（SNR）分辨率达2.7和10.7，背侧观胃/肾脏分辨率达3.0和21.8（支持信息图S16A），其代谢特征与既往研究高度一致，证明该技术可创新性评估多器官损伤。

进一步拓展的三通道成像技术中，尾静脉注射HD3-CD、灌胃HD6后腹腔注射HD14，915 nm通道（通道3）专属性显示HD14标记的肠道结构（图4D）。对照组与顺铂组的肝/肠SNR分辨率分别为11.1和14.0，胃/肠分辨率达4.6和4.2。相比双通道成像，三通道技术能提供更全面的器官信息并规避病灶导致的成像缺失，但因肠道蠕动和HD14的渐进吸收，其长期监测能力稍逊。综上，本文建立了可定制的多通道成像技术体系，为探索药物多器官毒性及加速新药研发提供了新工具。

图5. AAs诱导多器官损伤的实时NIR-II成像和分析

马兜铃酸（AAs）是存在于马兜铃科植物中的毒性化合物，已知可诱发马兜铃酸肾病。通过双通道成像技术，研究者期望为发现AAs更多潜在毒性提供有效证据。实验小鼠分别口服代表性AAs（20 mg/kg，包括AA-I、AA-II、AA-IIIa、AA-IVa和AL-I）及PBS对照组，治疗6天后尾静脉注射HD3-CD并灌胃HD6（图5A-B），利用近红外成像监测肾脏、肝脏和胃部信号（图5C）。结果显示：HD3-CD注射1小时后，各处理组小鼠肾脏信号衰减值分别为AA-I（0.03±0.04）、AA-II（0.07±0.04）、AA-IIIa（0.35±0.07）、AA-IVa（0.26±0.09）、AL-I（0.30±0.10）和PBS组（0.31±0.08），其中AA-I和AA-II组的肾清除效率显著低于其他组（图5D）；注射5小时后，AA-I和AA-II组的肝脏信号衰减值（0.12±0.07和0.18±0.07）显著低于对照组（0.28±0.05）及其他处理组（图5E）；胃部荧光信号在AA-I和AA-II组持续偏高，3小时时强度分别达对照组的9.3倍和9.7倍（图5F）。图5G综合对比显示，AA-I和AA-II组的探针清除效率在肝（5小时）、肾（1小时）、胃（3小时）三个器官均低于AA-IIIa、AL-I和PBS组，表明AA-I和AA-II对肝脏、肾脏及胃功能均有显著损害。血液生化指标（图5H）与病理切片进一步验证该结果与探针清除效率变化趋势一致。本研究首次通过双色成像技术揭示了AA-I和AA-II可能引发的胃排空障碍。

图6. AA-I/II诱导的肝、肾和胃损伤的蛋白质印迹和转录组分析

之后，本文通过Western blot分析了AA-I和AA-II处理组小鼠肝肾组织中炎症相关蛋白（NF-κB、NLPR3）、纤维化相关蛋白（TGF-β、SMAD3）及凋亡标志物（BAX）的表达水平。肾脏中，与对照组相比，AA-I组的BAX、TGF-β、NLPR3和NF-κB表达均升高，AA-II组的BAX和NF-κB显著上调（图6A）；肝脏中，两种处理组的BAX、TGF-β、SMAD3、NLPR3和NF-κB表达均明显增加（图6B）。进一步对AA-I和AA-II处理组的胃组织进行转录组学分析，主成分分析显示组间样本分散而组内聚类良好（图6C）。差异基因分析发现，AA-I组共有1936个差异基因（上调1268个，下调668个）（图6D），AA-II组达5973个（上调2757个，下调3216个）（图6E）。KEGG富集分析表明，AA-I主要影响细胞因子-受体相互作用、病毒蛋白-细胞因子互作、补体凝血级联、IL-17信号通路、蛋白质消化吸收及趋化因子信号通路（图6F）；而AA-II则显著干扰核糖体、蛋白质消化吸收、细胞黏附分子、胃酸分泌及血管平滑肌收缩等通路（图6G），提示两种毒素通过不同分子机制干扰胃功能动态平衡。

参考文献

Jiang Pu et al., Rapid discovery of drug-introduced multiple organ dysfunction via NIR-II fluorescent imaging, Acta Phar-maceutica Sinica B

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