使用chameleon冷冻电镜样本制备系统进行厌氧蛋白冷冻电镜制样新方法

2025-09-03 来源:本站点击次数:103

背景

固氮酶是生物界唯一能将大气中氮气（N₂）还原为氨（NH₃）的酶，这一过程称为生物固氮，是地球氮循环的关键环节。氨是所有生物合成蛋白质、核酸等含氮化合物的基础原料，因此固氮酶对维持生态系统和农业生产至关重要。

MoFe 蛋白（钼铁蛋白）包含两个复杂金属簇：

P-cluster（Fe₈S₇簇）：负责电子传递；

FeMoCo（铁钼辅因子）：直接催化 N₂ 还原。

Fe 蛋白（铁蛋白）：通过水解 ATP 驱动电子向 MoFe 蛋白传递。

固氮酶的金属簇（尤其是 FeMoCo）在有氧条件下会迅速氧化分解，导致固氮酶失活。天然界的中有一种蛋白质FeSII可以保护固氮酶免受氧气损伤，当氧气浓度升高时， FeSII构象从 “闭合态” 转变为 “开放态”，暴露疏水表面。这时FeSII 会与 MoFe 蛋白和 Fe 蛋白结合，形成长丝状的FeSII - 固氮酶复合物。这种结构通过物理隔离将 FeMoCo 包裹在内部，阻止 O₂接触活性中心。

图1：电镜下长丝状的FeSII-固氮酶复合物

挑战
厌氧蛋白冷冻电镜载网制备的核心挑战在于：传统的冷冻电镜样品制备流程包括将蛋白质溶液滴在载网上，然后通过滤纸吸干 (blotting) 去除多余液体，最后快速浸入液氮冷却的液态乙烷中进行玻璃化冷冻，然而对于氧敏感蛋白的研究，滤纸吸干步骤会导致样品短暂暴露于空气中，加剧氧敏感蛋白的氧化损伤。此外，吸干过程本身也可能对蛋白质结构造成机械损伤；其次，因所有进入厌氧箱的物品均需先经过脱气循环，物料转移过程不仅困难且耗时。

结果
最近来自加州大学圣地亚哥分校的F. AkifTezcan和Mark A.HerzikJr.团队利用最新的全自动冷冻电镜设备chameleon成功解析了在厌氧条件下的FeSII-固氮酶复合物的高分辨率冷冻电镜结构，相关结果在Nature 发表题为“Structural basis for the conformational protection of nitrogenase from O₂” 的文章。

图2： FeSII-固氮酶复合物冷冻电镜结构

方法

在2025年5月，F. AkifTezcan和Mark A.HerzikJr.团队在Nature Communication 发表题为“Preparation of oxygen - sensitive proteins for high - resolution cryoEM structure determination using blot - free vitrification”文章分享了如何使用chameleon进行厌氧蛋白冷冻电镜制样的具体方法。

图3：chameleon制备厌氧蛋白的具体步骤

1．将氧气敏感蛋白放入到厌氧箱中操作，在样品管中加入10~15uL蛋白样品，随后小心在样本上方铺设约 70 μL 阿尔油（Al’s oil，Hampton Research 品牌），直至油层与样本管管口齐平，再放入到玻璃锥形底反应瓶（Reacti-Vial，Thermo Fisher Scientific 品牌），转运至 chameleon 仪器。

图4：样本管油相密封样品避免空气接触

2. 载网玻璃化过程中，液态乙烷温度维持在 - 173~-175℃，湿度罩相对湿度（RH）维持在 > 75%。每组样本加载 2~4 张 chameleon 自吸附载网（Quantifoil Active 300 mesh），在 12 mA 电流下进行 40~45 秒辉光放电处理。

3. 载网辉光放电完成后，打开反应瓶橡胶塞，立即将 chameleon 样本杯小心装入仪器；吸取 7 μL 样本至分配器，确认样本可正常滴加后，再将样本滴加至载网。若喷样器吸头残留油相（可在chameleon软件中实时查看,见图5），可将喷液压力（amplitude）提高 2 倍（约 800），尝试去除吸头油污；若无效，每次增加 100 amplitude直至观察到液滴（最大不超过 1200）；若振幅升至 1200 仍有油污残留，选择Mini Prime功能，再执行Wipe Dispenser”，确保喷头彻底干净、无油污残留；最终将调整至可喷出4~5滴样品为佳。

图5：chameleon喷样器喷液检查

4. 确定最佳样本滴加条件后，以 300~900 ms的 plunge 冷冻时间进行快速制样；从样本装入仪器到第一张载网玻璃化的时间控制在 90~120 秒，后续每张载网需在前一张冷冻后的 60~120 秒内完成；筛选与数据收集过程中，优先选择第一张载网进行操作。

未来
随着越来越多的科研团队认识并使用 chameleon，不仅在厌氧蛋白冷冻电镜制备领域，chameleon 已助力科研人员攻克更多关于各种蛋白冷冻电镜的科学难题，2025年上半年已经发表超过10篇文章，为我们揭示更多生命微观世界的奥秘，推动结构生物学乃至整个生命科学领域迈向新的高度。如果您也在为您的蛋白冷冻电镜制备而烦恼，不妨试试 chameleon，开启你的科研新征程！

引用文献
[1] Narehood, Sarah M. , et al. "Structural basis for the conformational protection of nitrogenase from O2." Nature 637.8047(2025).

[2] Cook, Brian D. , et al. "Preparation of oxygen-sensitive proteins for high-resolution cryoEM structure determination using blot-free vitrification." Nature Communications 16.1(2025).

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