iPSC-CM和成年鼠心肌细胞光学电生理的高通量动作电位测定
2025-09-04 来源:本站 点击次数:21
高通量心肌细胞功能综合测评系统系统通过双通道荧光检测和高速视像追踪技术，捕获心肌细胞的钙离子浓度的动态变化以及膜电位信号，并结合光学高速相机同步获取细胞的实时收缩幅度、收缩速率和频率等参数。适用多样本实验包括动物成年鼠心肌、乳鼠心肌单细胞与多细胞组织（2D/3D）的检测如人源诱导多能干细胞（hiPSC）分化的心肌细胞、成人心肌细胞及3D心肌微组织。系统采用封闭式显微镜成像主体适配35mm单孔/24孔板设计，每日（按8小时算）可完成超过1000个细胞样本实验，显著提升实验效率。结合机器学习算法，自动识别目标细胞、跟踪运动轨迹，并生成标准化报告（如收缩速度、同步性、钙瞬变峰值时间等），佰诺仕生命科技引进大湾区首个IonOptix MultiCell HST 高通量心肌细胞收缩功能测量系统并高效完成iPSC-CM和成年鼠心肌细胞的光学电生理的动作电位测定。
不同的心肌细胞模型，如诱导多能干细胞衍生的心肌细胞(iPSC-CMs)和原代成年心肌细胞，展现出不同的生理特性。与成年细胞相比，iPSC-CMs表现出不成熟电生理特性，这可能影响电压染料加载和信号行为。这些差异主要归因于它们的发育状态和改变的离子通道表达谱。此外，我们还观察到iPSC-CMs中染料的摄取效率受到培养密度的影响，高培养密度通常支持更均匀的标记。相比之下，初级成年心肌细胞具有更复杂的膜结构，并且更容易受到化学或机械处理的影响。这些模型特有的特性需要经过优化的FluoVolt加载方案，以确保有效的标记并准确捕捉细胞功能。
本应用笔记描述了iPSC-CMS与主要成年心肌细胞在实验设置、染料加载和重新加载程序以及光毒性方面的关键差异。
iPSC-CMS:使用标准的分化方案衍生出人类iPSC-CMS。细胞在35毫米的培养皿上以不同的汇合度(20%和80%)进行培养。
初级心肌细胞:从8周大的C57BL/6小鼠左心室中分离出成年心肌细胞，并在分离后2-4小时内将其铺排在35毫米的培养皿上进行信号记录。
系统设置：
荧光记录使用lonOptix MultiCell 系统进行。FluoVolt的激发由470纳米LED(Cairn)提供，并通过470/40x带通滤波器。经过滤波的激发光在显微镜内被505纳米二向色长通镜(Chroma)反射，并通过UPlanXApo40x0.95 NA物镜(olympus)聚焦于样品上。FluoVolt的荧光信号经过535/36带通滤波器过滤，并使用光电倍增管进行检测。主要的心肌细胞通过MyoPacer(lonoptix)进行电刺激，采用双相脉冲模式(4毫秒持续时间，1赫兹频率，20伏电压。iPSC衍生的心肌细胞在无刺激情况下被记录。
IonWizard设置
在lonWizard中，iPSC源性心肌细胞(iPSC-CMS)和初级心肌细胞实验之间的主要设置差异是用于记录荧光信号的采样率。该速率需要超过动作潜能(AP)的速度，以避免遗漏重要的细节。
表2.在初级成年和iPSC衍生的心肌细胞中FluoVolt的加载后者使用了不同的协议以获得相对的密度水平。
观察结果
染料重新加载
在iPSC-CMs中重新加载FluoVolt是可能的，使用与初始应用相同的装载条件，在12小时后进行。
光毒性评估
在使用FluoVolt测量动作电位时，常见的问题是光毒性潜力和APD的假性延长。
iPSC-CMS:
记录的30秒自发活动显示没有可检测到的信号衰减(图2A)，也没有多个区域出现APD90延长(图2B)。
图2.(A)1代表性动作电位记录，在iPSC衍生的心肌细胞(iPSC-CMs)分化后第10天以1000 Hz捕获在室温下于HBSS中记录(B)APD90值，每簇跟踪27个瞬态，未发现显著延长迹象，表明无光毒性，n=5,N=1。
成年CMs-急性兴奋测试:FluoVolt信号在受控的成年原代CM上记录10秒(1Hz)。在对照条件下(HBSS)，多个细胞中均未观察到动作电位峰后出现显著平台期(图3A)或APD90延长(图3B)，这表明FluoVolt刺激在此时间段内未引起光毒性效应或人为APD90延长。
为了解决细胞是否可以在10秒内进行重复激发而不进行人工AP延长，以及它们是否对肾上腺素能刺激做出适当反应，我们进行了第二轮测量，添加10uM异丙肾上腺素(ISO)。在先前在HBSS下记录的相同细胞中，APD90在第一个到第十个瞬变期保持稳定(图-3，C)。与HBSS处理的对照组相比，ISO处理导致APD90在多个细胞中的预期缩短(图3、D和E)，这与其已知的生理效应一致。
我们的研究结果表明，10秒的兴奋不会诱导光毒性，作为动作电位的反应保持稳定的重复刺激时，记录间隔几分钟，细胞保持正常的反应肾上腺素能刺激。
图3.(A)在1000赫兹下从小鼠成年心肌细胞获得的代表性动作电位轨迹，记录在HBSS中，温度为37摄氏度。
成年鼠心肌细胞：图3(续)((B)在HBSS中对每个细胞的10个过渡期进行APD90测量，未观察到显著的延长，表明实验条件没有光毒性效应。(C)APD90测定添加10μu异丙肾上腺素，每细胞嗾路0个瞬态，显示无明显延长，进一步证实重复测量后没有光毒性。(D)异丙肾上腺素治疗前后小鼠原代成年心肌细胞正常化动作电位信号的平均值(E)异丁肾上腺皮质激素治疗前后的APD90，与HBSS相比，异丁肾治疗后的APD90显著降低，表明对异丁肾上的腺皮质兴奋剂的预期反应，数据使用配对2尾学生t试验分析。面板D和E，数据以平均值土 表示。
成年CMs-长时间激发测试:
为了评估长时间FluoVolt激发是否导致光毒性，原代心肌细胞被持续刺激(1Hz)，并在80秒内记录荧光信号。光毒性效应大约在25秒后变得明显，之后信号质量逐渐下降(图4)。
这对 lonOptix标准钙信号和收缩力系统的用户尤其重要，因为这些系统中长时间光暴露的可能性较高。为了在基于FluoVolt的记录中最大限度地减少光毒性影响，我们建议采取以下措施:
将荧光信号采集限制在每个细胞的20秒内。在定位新细胞时，通过点击lonWizard实验窗口中的暂停按钮来暂停激发，以避免不必要的LED光暴露。使用光圈将激发限制为每次单个细胞。
对于Multicell Lite和MultiCell/MultiWell HTS用户，当光照为孔状而非全场，且仅在活跃测量期间触发LED时，仍建议:
限制每个单元格的采集时间为20秒
避免在同一感兴趣区域(ROI)内立即重复记录。
图4.来自小鼠左心室原代成年心肌细胞的代表性动作电位记录，采样频率为1000 Hz，通过扩展的光刺激显示光毒效应的起始及其发展过程。
该项目由佰诺仕（广州）生命科技广州南沙实验室的MyoScreen®心血管心肌细胞/组织功能测试服务平台完完成，采用目前最新的自动化系统的IonOptix MultiCell HST 高通量心肌细胞收缩功能测量系统完成收缩/钙/电位等参数。
- 关键词：
- 引言：
不同的心肌细胞模型，如诱导多能干细胞衍生的心肌细胞(iPSC-CMs)和原代成年心肌细胞，展现出不同的生理特性。与成年细胞相比，iPSC-CMs表现出不成熟电生理特性，这可能影响电压染料加载和信号行为。这些差异主要归因于它们的发育状态和改变的离子通道表达谱。此外，我们还观察到iPSC-CMs中染料的摄取效率受到培养密度的影响，高培养密度通常支持更均匀的标记。相比之下，初级成年心肌细胞具有更复杂的膜结构，并且更容易受到化学或机械处理的影响。这些模型特有的特性需要经过优化的FluoVolt加载方案，以确保有效的标记并准确捕捉细胞功能。
本应用笔记描述了iPSC-CMS与主要成年心肌细胞在实验设置、染料加载和重新加载程序以及光毒性方面的关键差异。
上图表示各种样本的收缩测量方法
- 方法：
iPSC-CMS:使用标准的分化方案衍生出人类iPSC-CMS。细胞在35毫米的培养皿上以不同的汇合度(20%和80%)进行培养。
初级心肌细胞:从8周大的C57BL/6小鼠左心室中分离出成年心肌细胞，并在分离后2-4小时内将其铺排在35毫米的培养皿上进行信号记录。
系统设置：
荧光记录使用lonOptix MultiCell 系统进行。FluoVolt的激发由470纳米LED(Cairn)提供，并通过470/40x带通滤波器。经过滤波的激发光在显微镜内被505纳米二向色长通镜(Chroma)反射，并通过UPlanXApo40x0.95 NA物镜(olympus)聚焦于样品上。FluoVolt的荧光信号经过535/36带通滤波器过滤，并使用光电倍增管进行检测。主要的心肌细胞通过MyoPacer(lonoptix)进行电刺激，采用双相脉冲模式(4毫秒持续时间，1赫兹频率，20伏电压。iPSC衍生的心肌细胞在无刺激情况下被记录。
IonWizard设置
在lonWizard中，iPSC源性心肌细胞(iPSC-CMS)和初级心肌细胞实验之间的主要设置差异是用于记录荧光信号的采样率。该速率需要超过动作潜能(AP)的速度，以避免遗漏重要的细节。
- iPSC-CMs的 AP 通常较慢，因此可以使用较低的采样率-例如250Hz、500 Hz 或 1000 Hz-。较低的采样率也有助于减少噪声，但可能错过快速信号变化(图1)。用户应根据动作电位的速度选择采样率。
- 原代心肌细胞的发射速度更快，因此采样率至少需要1000赫兹。在某些情况下建议使用2000赫兹。或取样不足的指示是，如果荧光信号在痕迹上的TTL步进信号之前达到峰值。如果发生这种情况，请提高采样率。
图1.较低的数据采集速率可能会导致欠采样和数据信息减少，尽管信号更干净。
方法(续)
为了准确捕捉心肌细胞中的电压敏感染料信号，需要在lonWizard中进行两项关键调
整:
1.在硬件管理器下配置硬件计时器(ZPT读取频率)
2.在实验周期设置中设置采样频率。
以下是iPSC-CMs和初级心肌细胞的推荐计时器值和采样率摘要
为了准确捕捉心肌细胞中的电压敏感染料信号，需要在lonWizard中进行两项关键调
整:
1.在硬件管理器下配置硬件计时器(ZPT读取频率)
2.在实验周期设置中设置采样频率。
以下是iPSC-CMs和初级心肌细胞的推荐计时器值和采样率摘要
表2.在初级成年和iPSC衍生的心肌细胞中FluoVolt的加载后者使用了不同的协议以获得相对的密度水平。观察结果染料重新加载
在iPSC-CMs中重新加载FluoVolt是可能的，使用与初始应用相同的装载条件，在12小时后进行。
光毒性评估
在使用FluoVolt测量动作电位时，常见的问题是光毒性潜力和APD的假性延长。
iPSC-CMS:
记录的30秒自发活动显示没有可检测到的信号衰减(图2A)，也没有多个区域出现APD90延长(图2B)。
图2.(A)1代表性动作电位记录，在iPSC衍生的心肌细胞(iPSC-CMs)分化后第10天以1000 Hz捕获在室温下于HBSS中记录(B)APD90值，每簇跟踪27个瞬态，未发现显著延长迹象，表明无光毒性，n=5,N=1。成年CMs-急性兴奋测试:FluoVolt信号在受控的成年原代CM上记录10秒(1Hz)。在对照条件下(HBSS)，多个细胞中均未观察到动作电位峰后出现显著平台期(图3A)或APD90延长(图3B)，这表明FluoVolt刺激在此时间段内未引起光毒性效应或人为APD90延长。
为了解决细胞是否可以在10秒内进行重复激发而不进行人工AP延长，以及它们是否对肾上腺素能刺激做出适当反应，我们进行了第二轮测量，添加10uM异丙肾上腺素(ISO)。在先前在HBSS下记录的相同细胞中，APD90在第一个到第十个瞬变期保持稳定(图-3，C)。与HBSS处理的对照组相比，ISO处理导致APD90在多个细胞中的预期缩短(图3、D和E)，这与其已知的生理效应一致。
我们的研究结果表明，10秒的兴奋不会诱导光毒性，作为动作电位的反应保持稳定的重复刺激时，记录间隔几分钟，细胞保持正常的反应肾上腺素能刺激。
图3.(A)在1000赫兹下从小鼠成年心肌细胞获得的代表性动作电位轨迹，记录在HBSS中，温度为37摄氏度。成年鼠心肌细胞：图3(续)((B)在HBSS中对每个细胞的10个过渡期进行APD90测量，未观察到显著的延长，表明实验条件没有光毒性效应。(C)APD90测定添加10μu异丙肾上腺素，每细胞嗾路0个瞬态，显示无明显延长，进一步证实重复测量后没有光毒性。(D)异丙肾上腺素治疗前后小鼠原代成年心肌细胞正常化动作电位信号的平均值(E)异丁肾上腺皮质激素治疗前后的APD90，与HBSS相比，异丁肾治疗后的APD90显著降低，表明对异丁肾上的腺皮质兴奋剂的预期反应，数据使用配对2尾学生t试验分析。面板D和E，数据以平均值土 表示。成年CMs-长时间激发测试:
为了评估长时间FluoVolt激发是否导致光毒性，原代心肌细胞被持续刺激(1Hz)，并在80秒内记录荧光信号。光毒性效应大约在25秒后变得明显，之后信号质量逐渐下降(图4)。
这对 lonOptix标准钙信号和收缩力系统的用户尤其重要，因为这些系统中长时间光暴露的可能性较高。为了在基于FluoVolt的记录中最大限度地减少光毒性影响，我们建议采取以下措施:
将荧光信号采集限制在每个细胞的20秒内。在定位新细胞时，通过点击lonWizard实验窗口中的暂停按钮来暂停激发，以避免不必要的LED光暴露。使用光圈将激发限制为每次单个细胞。
对于Multicell Lite和MultiCell/MultiWell HTS用户，当光照为孔状而非全场，且仅在活跃测量期间触发LED时，仍建议:
限制每个单元格的采集时间为20秒
避免在同一感兴趣区域(ROI)内立即重复记录。
图4.来自小鼠左心室原代成年心肌细胞的代表性动作电位记录，采样频率为1000 Hz，通过扩展的光刺激显示光毒效应的起始及其发展过程。该项目由佰诺仕（广州）生命科技广州南沙实验室的MyoScreen®心血管心肌细胞/组织功能测试服务平台完完成，采用目前最新的自动化系统的IonOptix MultiCell HST 高通量心肌细胞收缩功能测量系统完成收缩/钙/电位等参数。
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