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蛋白互作五种常见技术及操作步骤

2025-12-15     来源:本站     点击次数:69

蛋白 - 蛋白互作是国自然研究中几乎所有项目均会涉及的核心内容，以下梳理并列举 5 项相关技术：酵母双杂交系统（Y2H）、免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、免疫荧光（IF）共定位、邻近连接技术（PLA）（点击）。
 
❤️在介绍上述技术前，需明确以下关键注意事项：
  1. 不同技术的功能定位存在差异：部分技术适用于靶蛋白筛选（如酵母双杂交 Y2H），部分适用于互作验证（如邻近连接技术 PLA），还有部分兼具筛选与验证双重功能（如免疫共沉淀 Co-IP 联用蛋白质谱可实现筛选，联用 WB 则可完成验证）。因此，筛选类技术一般用于预实验阶段的靶点确定，验证类技术多用于明确具体分子后的功能验证。
  2. 上述技术可分为细胞体系与非细胞体系（In tube）两类：细胞体系技术更贴合生理研究背景，但易受多种干预因素影响；非细胞体系技术更易验证蛋白间直接互作，但难以完全还原体内真实场景，且对蛋白纯化操作要求更高。为确保研究结论的严谨性，蛋白 - 蛋白互作验证需同时结合细胞与非细胞体系开展。
  3. 上述技术在国自然项目设计中存在 “必备项” 与 “加分项” 之分（观点仅供参考），无需在方案中全面罗列，应结合研究需求合理选择。

一、酵母双杂交系统（Yeast Two-Hybrid System，Y2H）
核心用于目的蛋白结合靶蛋白的筛选（国自然中为可选技术），真核生物转录激活因子普遍具备两个独立结构域：DNA 结合域（BD）与转录激活域（AD）。二者单独存在时无转录激活活性，仅当空间上发生靠近，方可重组为具有活性的转录激活因子，进而启动下游基因转录。

操作步骤如下：
  1. 构建融合蛋白：将目标蛋白（蛋白 X）与 BD 融合形成 “诱饵”，将待筛蛋白（蛋白 Y）与 AD 融合形成 “猎物”。
  2. 转化酵母细胞：将编码两种融合蛋白的基因分别导入酵母细胞。
  3. 互作介导重组：若蛋白 X 与蛋白 Y 在酵母细胞内发生互作，其融合蛋白可使 BD 与 AD 靠近，重组为活性转录激活因子。
  4. 结果判定：活性转录激活因子会驱动报告基因（如 HIS3、lacZ 等）表达，通过检测报告基因活性即可判断蛋白间是否存在互作。

二、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）
兼具靶蛋白筛选与蛋白 - 蛋白互作验证功能（国自然必需技术），免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）以抗体与抗原的特异性结合为核心原理，用于解析蛋白间相互作用。细胞在非变性条件下裂解时，蛋白间的生理性互作状态可得以保留，利用靶蛋白特异性抗体进行沉淀时，与之结合的互作蛋白会随靶蛋白共同被捕获。


操作步骤如下：
  1. 细胞处理：收集细胞并进行裂解，裂解液中需添加蛋白酶抑制剂以抑制蛋白降解。
  2. 上清获取：细胞裂解后离心去除沉淀的细胞碎片，收集含可溶性蛋白的上清液。
  3. 免疫结合：加入靶蛋白特异性抗体及蛋白 A/G 偶联磁珠（或琼脂糖珠），于 4°C 孵育以实现抗体与靶蛋白的特异性结合。
  4. 复合物捕获：孵育结束后离心收集结合有蛋白复合物的珠子，弃去未结合的游离蛋白。
  5. 非特异洗脱：用裂解缓冲液多次洗涤珠子，去除非特异性结合的杂蛋白。
  6. 复合物释放：加入蛋白样品缓冲液并煮沸珠子，使结合的蛋白复合物从抗体 - 珠子复合物上释放。
  7. 结果分析：通过 SDS-PAGE 电泳分离蛋白复合物，再结合 Western blotting（验证已知互作蛋白）或质谱分析（筛选未知互作蛋白）进行结果解读。

三、GST 下拉实验（GST pull-down）
兼具靶蛋白筛选与蛋白 - 蛋白互作验证功能（国自然一般必需技术），GST pull-down 以谷胱甘肽 S - 转移酶（GST）与谷胱甘肽（GSH）的高亲和力结合为核心原理，将 GST 融合蛋白固化于谷胱甘肽包被的琼脂糖珠上作为 “诱饵”，用于捕获体系中与之发生相互作用的 “猎物蛋白”，该方法多用于体外蛋白互作的检测与验证。

操作步骤如下：
  1. 构建携带 GST 标签的融合蛋白表达载体，转染至原核或真核表达系统中进行蛋白表达。
  2. 收集表达菌株或细胞并完成裂解操作，裂解液中需添加蛋白酶抑制剂以防止目标蛋白降解。
  3. 将细胞裂解物与固化有 GST 标签蛋白或 GST 融合蛋白的琼脂糖珠充分混合，置于 4℃条件下孵育数小时。
  4. 离心收集结合蛋白复合物的琼脂糖珠，弃去未发生结合的游离蛋白组分。
  5. 选用适配缓冲液对琼脂糖珠进行多次洗涤，去除非特异性结合的杂蛋白。
  6. 向沉淀的琼脂糖珠中加入蛋白样品缓冲液并煮沸，洗脱结合的蛋白复合物。
  7. 通过 SDS-PAGE 电泳对洗脱的蛋白复合物进行分离，结合 Western blot 技术验证已知互作蛋白，或借助质谱分析筛选未知互作蛋白。

四、免疫荧光共定位（ImmunoFluorescence Colocalization）
通过蛋白亚细胞共定位结果佐证蛋白 - 蛋白互作关系（国自然一般必需技术），免疫荧光共定位技术是解析细胞内蛋白互作的可视化手段，其核心原理为利用两种不同发射波长的荧光标签（如绿色荧光蛋白 GFP、红色荧光蛋白 DsRed）分别标记两种目标蛋白，借助荧光显微镜观察二者在细胞内的空间分布是否重叠，进而为蛋白间的相互作用提供直观证据。
 

操作步骤如下：
  1. 构建目标蛋白与不同荧光蛋白的融合表达载体，转染至宿主细胞中实现蛋白表达。
  2. 待细胞培养至适宜密度后，采用固定液对细胞进行固定处理，维持细胞形态与蛋白定位。
  3. 依据实验需求，选用特异性荧光抗体对靶蛋白进行免疫标记（若为荧光蛋白融合表达则可省略此步）。
  4. 利用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像观察，采集荧光信号图像。
  5. 运用图像分析软件处理采集到的图像，计算共定位系数，对两种蛋白的共定位程度进行定量评估。

五、邻近连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）
核心用于蛋白 - 蛋白互作验证（国自然设计中可作为加分项），邻近连接技术（PLA）是一类兼具检测与定量功能的蛋白分析技术，可用于验证蛋白 - 蛋白互作、检测蛋白表达水平及解析翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化、糖基化等）。其核心原理为采用一对携带寡核苷酸标签的 PLA 探针（偶联寡核苷酸的二抗），当两种探针分别结合靶蛋白后，若靶蛋白存在互作则探针间距会处于临界近距离，此时探针上的寡核苷酸可在连接酶作用下形成闭环 DNA 模板；通过滚环扩增（RCA）技术实现信号级联放大后，最终以荧光或显色方式完成可视化检测。

操作步骤如下：
  1. 样本制备：对细胞或组织样本进行固定及透化处理，确保探针可有效结合靶蛋白。
  2. 封闭处理：对样本进行封闭以阻断非特异性结合位点，降低背景干扰。
  3. 一抗孵育：加入两种特异性一抗，分别与两种靶蛋白的不同表位特异性结合。
  4. PLA 探针孵育：加入两种 PLA 探针（带寡核苷酸标签的二抗），使其与对应的一抗特异性结合。
  5. 连接反应：若两种靶蛋白存在互作，结合的 PLA 探针会充分靠近，此时连接酶可将探针上的寡核苷酸连接，形成环状 DNA 模板。
  6. 滚环扩增：采用 RCA 技术对环状 DNA 模板进行扩增，生成大量串联重复的 DNA 产物，实现信号放大。
  7. 检测分析：加入荧光标记的探针与扩增产物结合，通过荧光显微镜观察荧光信号，同时完成定性判断与定量分析。

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乐备实（LabEx）提供 PLA 实验服务，还有免疫荧光原位杂交检测：

货号 产品名
LXR-PLA PLA可视化蛋白互作试剂盒

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