均相时间分辨荧光共振能量转移技术的原理、优势、应用与进展
2025-12-16 来源:本站 点击次数:38均相时间分辨荧光共振能量转移（Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer, TR-FRET）是一种将时间分辨荧光技术与Förster共振能量转移原理相结合的高灵敏度检测平台。该技术通过物理距离依赖的能量转移现象，定量分析分子间相互作用，已成为生物化学研究、药物筛选和信号通路分析不可或缺的核心工具。
相较于传统FRET，TR-FRET引入了长寿命镧系元素荧光团作为供体，通过时间延迟检测有效消除短寿命背景荧光的干扰。这种创新结合了FRET对分子距离的高度敏感性与时间分辨技术的高信噪比优势，实现了在复杂生物样本（如细胞裂解物或完整细胞培养体系）中进行免洗、均相检测的突破。
1. Förster共振能量转移原理
FRET现象基于非辐射能量转移机制：当供体荧光团处于激发态时，若受体荧光团处于空间邻近状态（典型距离为2-9纳米）且满足光谱重叠条件，能量可通过偶极-偶极相互作用转移至受体。能量转移效率与供体-受体距离的六次方成反比，这一特性使FRET成为检测分子相互作用的“光学分子尺”。
传统FRET技术常使用荧光蛋白对（如CFP/YFP），但其应用受限于生物样本的自发荧光和散射光产生的高背景噪声。
2. 时间分辨荧光的技术革新
TR-FRET的技术突破在于采用镧系元素（如铕Eu³⁺、铽Tb³⁺）螯合物作为供体荧光团。这类荧光团具有以下独特光物理性质：
毫秒级荧光寿命：远超传统荧光团（纳秒级）和生物样本自发荧光（微秒级）
大斯托克斯位移：激发波长（~340 nm）与发射波长（>600 nm）间隔较大
尖锐发射峰：发射光谱窄，易于与受体信号区分
通过引入数百微秒的时间延迟，待短寿命背景信号完全衰减后，再采集长寿命镧系元素信号，实现了背景信号的物理性消除。
三、TR-FRET检测系统构成1. 荧光对配置
典型的TR-FRET系统包含以下核心组件：
供体体系：Eu³⁺或Tb³⁺螯合物（如Eu⁺-穴状化合物），激发波长为320-340 nm
受体体系：传统有机荧光团，如别藻蓝蛋白（APC，发射~665 nm）或荧光素衍生物（发射~520 nm）
连接策略：通过抗体-抗原、生物素-链霉亲和素、或直接标记等方式将荧光团与目标分子偶联
2. 检测与信号处理流程
检测过程遵循标准化时序：
1.脉冲激发：以脉冲方式激发供体荧光团
2.时间延迟：等待60-100微秒，使短寿命背景荧光衰减
3.信号采集：在特定时间窗口内同步检测供体发射信号（内参通道）和受体发射信号（检测通道）
4.比率计算：计算受体信号与供体信号的强度比值，实现信号归一化
比率测量法有效校正了孔间差异、液体处理误差及样品自身的光吸收或淬灭效应，显著提升了数据的准确性和重现性。
四、技术优势与应用特点1. 主要技术优势
超高灵敏度：时间分辨机制将检测限降至皮摩尔乃至飞摩尔水平
均相免洗检测：无需分离步骤，适用于自动化高通量筛选
宽动态范围：比率测量提供超过3个数量级的线性响应
抗干扰能力强：对样品颜色、浊度及化合物干扰具有良好的耐受性
实验灵活性：适用于细胞裂解物、完整细胞及纯化蛋白等多种体系
2. 典型应用领域
TR-FRET技术在生命科学研究中已实现广泛应用：
分子相互作用研究
蛋白质-蛋白质相互作用：激酶-底物、受体-配体、抗体-抗原
蛋白质-核酸相互作用：转录因子-DNA、RNA结合蛋白-RNA
小分子-靶标结合：药物候选物与靶蛋白亲和力测定
翻译后修饰检测
磷酸化状态定量：通过磷酸化特异性抗体建立检测体系
泛素化、乙酰化等修饰分析
细胞信号通路分析
GPCR信号转导：第二信使产生、β-arrestin募集
激酶活性测定：检测底物磷酸化水平
细胞因子信号：STAT蛋白磷酸化与核转位
生物标志物定量
血清或组织样本中低丰度生物标志物的高灵敏度检测
1. 荧光对选择策略
Eu³⁺/APC组合：经典配置，适用于多数应用，发射波长差异明显
Tb³⁺/荧光素组合：适用于需要更高供体亮度或绿色检测通道的场景
多色TR-FRET：利用不同镧系元素与受体的组合，实现多重检测
2. 标记方法优化
抗体标记需考虑荧光团与抗体摩尔比，平衡灵敏度与背景
直接标记策略（如His标签与镧系元素螯合抗体）可减少空间位阻
对于小分子互作研究，需评估标记对结合亲和力的潜在影响
3. 检测条件优化
缓冲液成分应避免强淬灭剂（如叠氮化钠）
优化供体与受体标记浓度比例，最大化信噪比
对于细胞实验，需评估细胞密度和培养条件对信号的影响
1. 新型荧光团开发
更亮的镧系元素螯合物，提升检测灵敏度
新型受体荧光团，扩展光谱范围
时间分辨荧光纳米材料，实现信号多重放大
2. 检测模式创新
结合荧光寿命成像（FLIM），实现空间分辨率
开发活细胞TR-FRET实时监测系统
整合微流控技术，实现单细胞水平检测
3. 自动化与数据分析
智能化数据分析算法，自动识别非特异性结合
与人工智能结合，优化实验条件预测
云平台数据管理，促进标准化与共享
TR-FRET技术凭借其独特的时间分辨机制和FRET的分子距离敏感性，已成为分子互作研究和药物筛选的金标准方法之一。其均相、免洗的特性特别符合现代高通量、自动化药物研发的需求。
未来发展方向将集中于进一步提升检测灵敏度、开发新型荧光探针、实现多重检测能力，并与成像技术、单细胞分析等前沿方法融合。随着技术的不断完善，TR-FRET有望在精准医疗、个性化治疗和基础生物学研究中发挥更加重要的作用，为理解生命过程的分子机制提供更强大的工具支持。
八、均相时间分辨荧光(TR-FRET)检测服务哪里有？
LabEx为您提供专业、灵敏的均相时间分辨荧光（TR-FRET）检测与开发服务。我们利用镧系元素荧光的时间分辨特性，有效克服传统荧光检测中背景荧光的干扰，为您提供超高通量、高信噪比的检测解决方案。该技术无需洗涤步骤，在“均相”体系中即可精确检测蛋白质-蛋白质相互作用、激酶活性、受体配体结合、cAMP水平及泛素化等多种生物学事件。
LabEx可提供以下激酶靶点药物研发方案:
1、激酶:Biotinylated、His、GST和Tag free200+余种激酶
2、激酶抑制剂筛选一均相时间分辨荧光(HTRF)技术,化学发光检测技术
3、细胞水平激酶检测;
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