TR‑FRET、THUNDER检测技术在PROTAC药物研发中的应用
2025-09-18 来源:本站 点击次数:44近年来，生物医药领域风起云涌，一种名为PROTAC（Proteolysis Targeting Chimera）的新型药物研发策略引起了广泛关注，被誉为“颠覆传统的小分子药物模式”。那么，PROTAC究竟是什么？它与传统药物有何不同？目前处于什么样的发展阶段？本文将为你一一解读。
一、PROTAC
PROTAC，全称为“蛋白降解靶向嵌合体”，是一种基于细胞内天然蛋白质降解机制的创新型小分子药物设计策略。
它的结构由三个部分组成：
靶蛋白配体（warhead）：能够选择性结合目标蛋白；
E3连接酶配体（ligand）：能结合泛素-蛋白酶体系统中的E3泛素连接酶；
连接臂（linker）：将两者连接起来。
通过将这两个配体连接在一起，PROTAC分子能将靶蛋白“送”到细胞的降解机器——泛素-蛋白酶体系统（UPS）中去泛素化降解，从而在系统水平上调控蛋白质的稳态。
图：基于小分子的PROTAC示意图
From：Zou Y, Ma D, Wang Y. The PROTAC technology in drug development. Cell Biochem Funct. 2019;37(1):21-30. doi:10.1002/cbf.3369
迄今为止，已有 30 多种对疾病发展至关重要的蛋白质成为靶向，其中主要致力于癌症治疗的蛋白质。靶向蛋白包括核受体（ER、AR 和 RAR）、蛋白激酶（Akt、BCR-Abl、c-Abl、BTK、ALK、CDK9、RIPK2、DAPK1 和 PSD-95）、转录调控蛋白（BRD4、Sirt2、HDAC6、TRIM24、IKZF1/3 和 Smad3）、调节蛋白（CRABP-I/II、TACC3、AHR、FKBP12、ERRα 和 X-protein）、神经退行性相关蛋白（Huntingtin、Tau、α-synuclein和 PSD-95）、细胞代谢酶（MetAP-2 和 DHODH）、 和融合蛋白（Halo tags）。
图：靶向蛋白、靶蛋白配体、E3泛素连接酶配体和E3泛素连接酶的总览
From：Zou Y, Ma D, Wang Y. The PROTAC technology in drug development. Cell Biochem Funct. 2019;37(1):21-30. doi:10.1002/cbf.3369
二、PROTAC主要优势
传统小分子药物的模式是“占位”——它们与靶点结合，抑制其活性。但这通常只适用于“有活性位点”的蛋白，很多被称为“不可成药靶点”（undruggable targets）的蛋白，因为缺乏合适结合位点，难以被传统药物“拿下”。
而PROTAC则是“破坏”策略。它不需要永久结合目标蛋白，仅需要暂时结合并引导其降解。一旦目标蛋白被降解，PROTAC分子可以“游走”去招募下一个目标。
那么，PROTAC的关键优势就有：
- 攻克“不可成药靶点”：PROTAC可以降解那些难以抑制的蛋白，如转录因子、结构蛋白等。
- 持续时间长、用量低：由于其可重复使用的机制，PROTAC往往具有更持久的药效。
- 减少耐药性：传统抑制剂常因突变产生耐药性，而PROTAC通过降解可减少这一问题。
- 选择性更强：通过设计linker和配体结构，PROTAC可以获得更高的靶点选择性。
三、PROTAC研发进展
自PROTAC概念首次提出以来，技术不断成熟。如今，全球已有多款PROTAC候选药物进入临床试验阶段，靶点涵盖癌症、炎症、自身免疫疾病等多个领域。
1．TRD209（SHP2靶向PROTAC降解剂）：
由北京泰德制药研发，成功破解“不可成药”的SHP2靶点，进入药物开发阶段，对急性髓系白血病（AML）和小细胞肺癌（SCLC）表现出开发潜力。
2．ARV‑471（雌激素受体降解剂）：
由 Arvinas与辉瑞合作开发，目前处于 III 期临床研究，获FDA快速通道资格，专注治疗ER+/HER2−乳腺癌。
3．BMS‑986365（AR靶点）：
Celgene启动了 III 期临床试验，针对去势抵抗性转移性前列腺癌（mCRPC），共有约 960例患者参与。
4．ARV‑102（LRRK2靶向降解剂）：
Arvinas发布首个人体临床结果，在健康志愿者中安全耐受性良好，有效降低中枢与外周LRRK2水平，为神经退行性疾病提供新的疗法。
虽然前景广阔，但PROTAC也面临不少挑战：
1. 分子量大、口服性差：PROTAC通常较大，影响口服生物利用度 。
2. 药代动力学复杂：在体内的稳定性、分布等仍需优化 。
3. E3连接酶数量有限：目前常用的E3酶较少（如VHL、CRBN），限制靶点拓展。
4. 免疫原性与安全性：长期降解特定蛋白可能影响正常生理过程 。
“分子胶（molecular glue）”等相关技术也在蓬勃发展，与PROTAC一起，共同推动新一代“降解型药物”平台的兴起。不可否认的是，靶向蛋白降解已经成为新药研发最炙手可热的方向之一，值得科研界与产业界持续关注。
四、TR‑FRET 技术在 PROTAC 研发中的应用：
TR‑FRET（Time‑Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer）是一种高灵敏的检测技术，用于检测PROTAC三元复合物结合。TR‑FRET 可一次性对PROTAC与靶蛋白、E3连接酶结合活性进行评估，无需多个分开试验，在筛选效率和成本上具备优势。
TR‑FRET 技术应用广泛，可快速转至其他靶标（如不同 BRDs）而无需更改 assay 条件，具备良好的模块化特性。
（一）PROTAC三元复合物结合
以GSPT1/CRBN三元结合为例
CC-885是一种新型的cereblon分子胶调节剂，它通过与cereblon (CRBN) 结合，利用CRL4CRBN E3泛素连接酶的功能，发挥抗肿瘤活性。其主要靶点是翻译终止因子GSPT1，CC-885能够促进GSPT1的CRBN依赖性泛素化和降解，从而在患者来源的急性髓系白血病肿瘤细胞中表现出高度敏感性，显示出其临床潜力。该实验用Europium-labeled Tag1和Acceptor-labeled Tag2检测CRBN/DDB1蛋白和GSPT1蛋白通过分子胶CC-885介导的相互作用。
图左CRBN与GSPT1检测原理图；图右CC-885介导CRBN与GSPT1结合曲线
其他应用实例包括 HDAC10 的 TR‑FRET 配体置换分析，可无需酶促底物，直接评估结合活性，为非传统靶标提供实验路径。
优宁维提供HDAC10 ELISA检测试剂盒（货号：abs551208-96T），采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被有Histone deacetylase 10 （HDAC10）捕获抗体的微孔中，依次加入样本、标准品、生物素标记的检测抗体，HRP 酶结合物，中间经过温育和洗涤，用底物TMB显色，TMB 在过氧化物酶（HRP）的催化下转化成蓝色并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Histone deacetylase 10 （HDAC10）呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。检测范围：78.1-5000pg/mL。
技术原理
THUNDER检测是基于双抗体夹心法，标记荧光供体和受体的抗体Eu-Ab1和FR-Ab2，分别与两个蛋白结合，产生能量共振转移FRET（615nm），进而产生665nm荧光信号，荧光信号强度与结合的蛋白浓度成正比，可直接监测三元复合物形成，也便于测定结合动力学指标。全程仅需1h，免洗，可高通量。检测灵敏度高，上限宽。
使用Bioauxilium 提供的Toolbox试剂进行实验的可能方案（如下图），是蛋白质A和蛋白质B之间的相互作用实验 的一些不同的实验组合。举例说明，蛋白质A带有Tag-a标签，蛋白质B可以是天然的（图A），或者将蛋白质B进行生物素化（图 B），或带有Tag-b（图C），或者将蛋白质B直接进行受体或供体标记（图D）。这几种示例中，两种蛋白的标签或标记都可以互换使用。
图：蛋白质A和蛋白质B相互作用实验方案
图A，使用带有供体标记的抗标签a抗体结合蛋白质A，并使用带有受体标记的抗蛋白质B抗体（定制或用用标记试剂标记）结合蛋白质B，产生FRET信号。
图B，使用带有供体标记的抗标签a抗体结合蛋白质A，用受体标记的链霉亲和素结合生物素化的蛋白质B产生FRET信号。
图C，使用带有供体标记的抗标签a抗体结合蛋白质A，并使用带有受体标记的抗Tag-b抗体结合蛋白质B，产生FRET信号。
图D，使用带有供体标记的抗标签a抗体结合蛋白质A，直接将蛋白质B进行受体标记，产生FRET信号。
下游实验检测
PROTAC药物研发下游实验涉及细胞因子、磷酸化蛋白的检测，TR-FRET可以快速筛选潜在候选分子，助力科学实验。
（1）细胞因子&生物标志检测
Human IFNγ 为例
THUNDER细胞因子检测是基于双抗体夹心法，标记荧光供体和受体的IFNγ抗体Eu-Ab1和FR-Ab2，分别与细胞上清中IFNγ结合，产生能量共振转移FRET（615nm），进而产生665nm荧光信号，荧光信号强度与IFNγ浓度成正比。全程仅需2h，免洗，可高通量。检测灵敏度高，上限宽。
Human IFNγ检测范围：32 – 30,000 pg/mL
图：Human IFNγ检测原理，流程及标曲
（2）磷酸化蛋白检测
THUNDER磷酸化蛋白和总蛋白检测是基于双抗体夹心法，标记荧光供体和受体的蛋白抗体Eu-Ab1和FR-Ab2，分别与细胞上清中目标蛋白结合，产生能量共振转移FRET（615nm），进而产生665nm荧光信号，荧光信号强度与目标蛋白浓度成正比。以磷酸化ERK为例，全程仅需4.5h，免洗，可高通量。检测灵敏度高，上限宽。
图3. THUNDER磷酸化蛋白检测原理示意图
该试剂盒已通过验证，适用于HEK293、H358、MCF7和B淋巴细胞裂解液中磷酸化- ERK1 /2（T202/Y204）的相对定量。用EGF处理HEK293细胞（50000个细胞/孔）与不同梯度浓度的EGF在室温下孵育10分钟。数据显示，EGF促进ERK磷酸化。饥饿处理不同密度的H358细胞18个小时，用不同梯度浓度的RMC-4550在37℃下孵育60分钟。数据显示，RMC-4550可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位点的磷酸化。用不同梯度浓度的L779,450处理不同密度的MCF7细胞，在37℃下孵育30分钟。数据显示，L779,450可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位点的磷酸化。在不含血清的RPMI中重悬不同密度的B淋巴细胞，用不同梯度浓度的L779,450在室温下孵育30分钟。数据显示，L779,450可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位点的磷酸化。
图. THUNDER Extreme Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)验证数据
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