文章来源公众号：生物快评           作者：sw

David Baker，2024诺贝尔化学奖的主，华盛顿大学教授

2025年9月29日David Baker，2024诺贝尔化学奖得主发表了一篇《Computational design of pH-sensitive binders》，这篇文章利用对Binder的结合界面增加组氨酸来让其具有pH的敏感性。

氨基酸的结构上，一端为氨基NH2，一端为COOH基团，中间为一个CH，其中CH上为侧链基团，R基团的差异就会导致氨基酸性质的改变。那么根据R基团的差异，可以将氨基酸分成4类：非极性氨基酸（就是不电离，不亲水的氨基酸）；极性氨基酸（就是不带电，但是亲水的氨基酸）；碱性氨基酸（即在中性pH下带正电的氨基酸）；酸性氨基酸（即在中性pH下带负电的氨基酸）。

20种氨基酸分类表（4大类）

Ka 是这个解离反应的平衡常数，其表达式为：

其中，[ ] 表示浓度。pKa值越小，酸性越强；pKa值越大，酸性越弱。

pKa 是Ka 的负常用对数：

氨基酸的电解，比如每个氨基酸都有电解常数1pKa1（COOH电解释放H+的能力），NH2基团的电解常数pKa2(即NH2释放H+的能力)。其中有7个氨基酸的R基团也能够电离，所以他们额外有了pK_R（即R基团电离释放H+的能力）。

这7个氨基酸即3个碱性氨基酸Lysine\Argine\Histidine，2个酸性氨基酸aspartic acid和glutamic acid。

以及1个亲水性的Cysteine，因为其侧链含有巯基（R-SH），该基团在碱性环境中可作为质子供体，失去质子后形成硫醇阴离子（R-S⁻）；一个疏水性的Tyrosine（酪氨酸的酚羟基可发生去质子化，该化学特性与苯酚（由苯环和氧原子构成）类似，固有pKr）。

在低pH（酸性）环境中，溶液中的H⁺浓度高，会抑制羧基的解离，并促使氨基结合H⁺。因此，氨基酸整体带正电荷。

在高pH（碱性）环境中，溶液中的OH⁻会中和H⁺，促使羧基解离释放H⁺，同时氨基也难以结合H⁺。因此，氨基酸整体带负电荷。

随着pH值从低到高变化，氨基酸的净电荷会从正电荷逐渐变为负电荷。在这个变化过程中，必然存在一个特定的pH值，使得氨基酸的正负电荷数恰好相等，净电荷为零。这个pH值就是该氨基酸的等电点（pI）。

如下图给出了20个氨基酸的pKa和pI值。

pH和一些细胞内吞过程有关系，比如新生儿Fc受体，FcRn

Biopolymers. 2017 Dec 21. doi: 10.1002/bip.23095.

新生儿Fc受体，是一种在整个生命体内都发挥重要作用的蛋白质。它最初是在新生儿肠道中被发现的，负责吸收母体乳汁中的抗体（IgG），因此得名。FcRn的核心功能是延长抗体（IgG）和白蛋白在体内的寿命。其工作机制非常独特，依赖于pH值的差异：

血液中的抗体（IgG）和白蛋白会被细胞通过“胞饮”作用随机地吞进细胞内，形成名为“内体”的小泡。内体内的环境是酸性的（pH约6.0-6.5）。酸性环境下结合：在酸性条件下，FcRn受体的结构会发生改变，使其能够与IgG或白蛋白的Fc段（恒定区）高亲和力地结合。可以理解为，在酸性“房间”里，FcRn能“认出”并“抓住”这些有用的分子。循环与释放：没有被FcRn结合的其它蛋白质会被运送到溶酶体中进行降解。而被FcRn“抓住”的IgG和白蛋白则会被安全地运输回细胞表面。中性环境下释放：当这个载有FcRn和其“货物”的小泡回到细胞表面时，会遇到血液中性的环境（pH约7.4）。在这个条件下，FcRn与IgG/白蛋白的亲和力急剧下降，于是释放它们回血液中。过程重复：这个循环过程周而复始，使得IgG和白蛋白在体内的半衰期（存活时间）非常长（IgG的半衰期约为21天）。

蛋白设计的目标，在蛋白质靶向降解的情况下，比如溶酶体靶向降解（Lysosome targeting chimeras (LYTACs)，需要一个binder，一端结合目标待降解分子，另一端靶向溶酶体循环受体（lysosome trafficking receptor (LTR)），这样binder同时靶向LTR和目标分子后，则会通过LTR内吞进入溶酶体将目标分子降解。传统的这类LYTAC技术没有考虑在lysosome中与目标分子的解离，导致了这类LYTAC binder分子在lysosome中也一同和目标分子一起水解，这样导致了LYTAC binder的使用量需要增加。

所以作者就想能不能设计一个LYTAC binder，和目标分子在中性pH下结合能力强，在酸性pH环境下结合能力下降而与目标分子解离。

那么怎么做到呢？

需要增加一些在pH酸性环境下，Binder的结合能力下降或者Binder自身的结构改变了。组氨酸是唯一侧链pKa值接近中性pH（~7.64）的氨基酸残基，这使得它对生物体内的pH梯度变化尤为敏感。循环系统中的pH值约为7.4，内吞体中为5.0-6.0，而肿瘤微环境（TME）中为6.0-6.5。根据其质子化状态的不同，组氨酸既能接受也能提供与带电残基之间的氢键。当环境pH低于其pKa值（约6.5）时，质子化的组氨酸可作为两个氢键的供体而非受体；而当环境pH高于pKa值时，去质子化的组氨酸既能作为一个氢键的供体，又能作为另一个氢键的受体——这第二个氢键在转移至pH6的酸性环境时会被破坏。

作者首先整体随机增加binder的His的比例，发现并没有效果。随后作者按照两种思路进行实验：思路1是在binder与目标分子结合的表面增加His，比如His在pH中性环境不影响binder结合目标分子，而pH酸性条件下，His携带H+而影响了对目标分子的结合，从而达到解离的效果（即interface destablization）。另一个思路就是在binder的内部增加His，在酸性pH环境下binder中His携带同电荷的H+而排斥作用从而达到了与目标分子的解离作用，这个思路的局限是需要这样的binder分子较大，否则His会提前暴露。

比如靶向EpA2的binder，经过interface destablization后，在pH=7.4下KD为678pM, 而在pH=5.4下，KD为15nM。所以EphA2 binder在酸性环境下亲和力下降~20倍。

效果上，显示pH-LYTAC在相同的剂量下可以靶向降解目标分子EphA2的能力显著增强（~90%降解），而常规LYTAC技术降解目标分子效率只有~50%，原因在与pH-LYTAC可以循环利用。

这篇文章的核心生化原理并不复杂，难度是在于将His“装饰”在binder的结合表面等，怎么保持不改变binder对目标分子在pH=7.4下的结合能力。因为我们知道这种binder的“结合表面”改动一个氨基酸都有可能改变binder的结合能力，甚至无法结合或者产生脱靶向能力。David baker实验室首先通过计算等办法找到结合的表面或者binder的核心，然后通过噬菌体展示技术进行筛选确定有效的binder。

作者David Baker为2024年诺奖得主，其实其导师，和导师的导师均获得了诺奖。见下：

David Baker于2024年因开发蛋白质折叠RossetaFold荣获诺贝尔化学奖。

Randy Wayne Schekman是David baker的博士生导师，博士期间研究DNA聚合酶，个人独立研究为囊泡运输，2013年谢克曼与詹姆斯·罗思曼和托马斯·聚德霍夫因为在细胞膜囊泡运输方面有开创性的发现而共同获得诺贝尔生理学或医学奖。

Randy Wayne Schekman的博士生导师是Arthur Kornberg(1918年3月3日—2007年10月26日），他研究研究DNA聚合酶而于1959年的诺贝尔生理学或医学奖。