文章来源公众号：大鱼科学            作者：大鱼科学

2025年诺贝尔生理学或医学奖花落调节性T细胞领域的开拓性研究。然而，如何充分驾驭T细胞的治疗潜力，仍面临诸多挑战。抛开“体内与体外制备CAR-T”的路径之争，如何设计出功能更强、持久性更好的CAR-T细胞，是两条技术路线共同面临的核心挑战。

遵循“优胜劣汰”的基本逻辑，通过在细胞中人为引入突变，再施以定向压力筛选出优势细胞，是借鉴“自然选择”进行定向筛选CAR-T的有效策略。追寻这一思路，在“体外制备CAR-T”中进行的“体外筛选”，已经产出了不少的成果。然而，最近的研究提示，仅仅将筛选环境由“体外”更换为“体内”，便会得出一些不同的结论了。

01 筛选：选择和演化
以往筛选产生的成果部分列举如下（表1）。然而，目前绝大多数发现均基于体外筛选平台获得，然后再转移至体内进行功能验证。这带来一个根本性问题：体外培养与杀伤体系中所施加的选择压力（如激活、扩增与存活条件）与体内生理环境存在差异，导致以“体外适应”为导向的筛选可能遗漏在“体内环境”中更具优势的细胞类型。

表1. 筛选得到的能够调控CAR-T适应性的基因列表举例

02 偏离：体内vs体外
一项最新研究揭示了这一差异的冰山一角。该研究以135个基因为筛选起点，构建了一个具有多样性基因缺失的CAR-T细胞混合群体，并将其回输至小鼠体内（图1）。研究团队在四个关键时间点进行采样：未经筛选的初始T细胞群体（-11天）、CAR-T生产结束时（0天）、体内作用早期（7天）及晚期（21天）。通过比较不同时间点特定基因缺失细胞类群的富集程度，可系统评估哪些基因的缺失有助于增强CAR-T细胞的功能与持久性。

图1. 体内筛选策略及采样时间点示意图。 实验中通过同步敲除TCR分子，实现对基因编辑后T细胞（CD3阴性群体）的特异性富集与追踪。

体内、外结果的偏离出现了：在体外制备阶段表现出明确优势的RASA2基因（具体表现为其在采样点2出现显著富集），在回输体内后并未保持这一趋势（图2）；相比之下，CDKN1B在体内环境中被稳定选择出来，具体体现为其在采样点3至采样点4期间呈现持续富集（图2）

图2. 特定基因敲除在CAR-T细胞体内持久性中的动态变化。 结果显示RASA2缺失在体外制备阶段（采样点2）显著富集，但在体内环境中未持续优势；CDKN1B缺失则在体内阶段（采样点3–4）表现出明显富集。

从治疗肿瘤的效果上看，RASA2缺失后在体外表现良好，但在体内并没有显著的改善；而CDKN1B则恰恰相反（图3）。

图3. 体内与体外筛选环境下出的基因缺失CAR-T在体内外肿瘤杀伤效果中的比较。

03 体内CART：筛选设计再思考
基于上述类似筛选策略探索增强CAR-T功能的基因，目前已积累多项研究成果。除表1所列基因外，一篇同期发表的研究亦提示了RHOG与FAS对CAR-T细胞的调控作用。这提示筛选策略的细微差别可能导致关键结论的不同；而筛选环境（体内与体外）的选择可能是导致结果差异的重要来源。值得注意的是，尽管当前大多数筛选实验仍建立在“体外制备CAR-T”的技术框架内，不同筛选环境导致的表型差异已显而易见。

体内制备的CAR-T在T细胞激活、扩增与杀伤机制等关键生物学行为方面，与体外制备的CAR-T存在明显差异。在此背景下，基于传统“体外制备CAR-T模型”所建立的CAR分子设计原则、筛选体系以及基因编辑调控策略，是否仍然适用于体内制备的CAR-T，目前尚无明确结论，提示了技术路径分歧背后深层次的关键科学问题。结合人工智能在设计生命（病毒）方面的进展，或许终有一天，人为定制设计CAR-T细胞也将成为现实。​