在人多能干细胞的研究世界中，iPS细胞无疑是最耀眼的明星。它们承载着疾病建模、药物筛选乃至未来再生医学的无限可能。然而，这些珍贵的细胞既娇贵又“永生”，如何让它们在需要时“暂停”生长，在未来的某一刻被完美“唤醒”，成为了每个实验室的必修课。今天，我们就来深入聊聊iPS细胞冻存的那些事儿——这不仅是一项技术，更是一门艺术。

给细胞一个时光胶囊
你可能会有疑问，iPS细胞不是可以无限增殖吗？为何还要大费周章地冻存？
资源保种：防止珍贵细胞系因连续传代、污染或意外而丢失。每一株iPS细胞系，尤其是来自特定患者的，都是独一无二的生物资源。
实验规划：在遗传操作、分化实验等关键节点前，冻存原始细胞，相当于设置了“安全存档点”。
降低成本：长期维持细胞培养耗费大量人力、物力和试剂成本。冻存可以让研究间歇期“零消耗”。
资源共享：便于在不同实验室、不同地区之间进行细胞系的交换与运输。
简单来说，冻存就是为iPS细胞打造了一个“生命暂停”的时光胶囊，确保我们在需要时，总能获得状态均一、纯净的起始材料。

冻存核心原理：与冰晶赛跑
细胞冻存的关键，在于如何避免细胞内形成致命的冰晶。冰晶会像无数利刺，摧毁细胞的膜结构和内部机器。我们的对策是：
慢速降温：使用程序性降温盒或可控速率降温仪，以每分钟下降1℃的速度缓慢冷却。这能让细胞内的水分有充足时间渗透到细胞外，减少细胞内冰晶的形成。
使用冻存液：冻存液中的DMSO 能降低细胞的冰点，增加膜通透性，帮助水分渗出。同时，会搭配胎牛血清或无双血清替代品作为保护基质，减少DMSO的毒性。
记住：冻存的敌人不是低温本身，而是形成冰晶的过程。

标准操作流程

【冻存前准备】
细胞状态是关键：选择对数生长期、形态良好、克隆边界清晰、无分化的细胞。冻存前24小时更换新鲜培养基。
高密度，高存活：消化离心后，用预冷的冻存液重悬细胞。建议冻存密度为1-3 x 10⁶ cells/mL。浓度过低会导致复苏后生长迟缓。

【冻存步骤】
消化收集：用常规消化法（如EDTA或Accutase）将细胞消化成单细胞悬液，离心。
配制冻存液：按比例配制冻存液（经典配方：90% 基础培养基/FBS + 10% DMSO）。现用现配，并置于冰上预冷，以最大限度减少DMSO对细胞的毒性。
重悬分装：用冻存液轻柔重悬细胞，并迅速分装至已标记的冻存管中（通常1-1.5mL/管）。确保标签信息清晰、防水。
程序降温：将冻存管立即放入程序性降温盒，并转移至-80℃超低温冰箱过夜（约12-24小时）。切勿直接放入-80℃或液氮！
长期保存：24小时内，必须将冻存管转移至液氮中长期保存。在-80℃中细胞会缓慢失活，只有液氮（-196℃）才能实现真正的“生命暂停”。

2TWO常见误区与避坑指南
误区一：细胞状态无所谓？
正解：冻存是细胞状态的“快照”。分化、状态不佳的细胞，冻存后再复苏，只会更差。

误区二：DMSO浓度越高越好？
正解：10%是经典安全浓度。过高会增加毒性，过低则保护不足。

误区三：冻存管可以直接扔进-80℃？
正解：快速冷冻会导致细胞内形成大量冰晶，细胞死亡率极高。程序性降温是必须步骤。

误区四：冻存后万事大吉？
正解：定期检查液氮罐液位，做好库存管理，防止因液氮耗尽导致全军覆没。

复苏
“秒”速水浴：从液氮中取出冻存管，立即放入37℃水浴锅中，不断摇晃，使其在1-2分钟内完全融化。
轻柔稀释：将细胞悬液转移至含有多倍体积预热培养基的离心管中，轻柔混匀。这一步是为了稀释对细胞有毒性的DMSO。
离心换液：离心后，弃去上清，用新鲜培养基重悬细胞，接种至辅有基质胶的培养皿中。
精心呵护：复苏后第二天及时换液，清除死细胞。密切关注细胞贴壁和生长情况。