理解低内毒素回收（LER）：FDA指南到PDA TR-82深度解析
2025-11-06 来源:公众号-湖州申科 点击次数:71在生物制品质量控制领域，低内毒素回收（Low Endotoxin Recovery，简称 LER）已成为一个不容忽视的挑战。它并非偶发技术问题，而是涉及配方成分、分析方法、法规要求及用药安全的多维风险控制问题。本文基于 FDA指南与PDA技术报告No.82（TR-82），从行业技术视角解读LER的本质、监管要求与LER实践路径。
一、LER的法规背景：FDA指南与监管逻辑
FDA虽未发布一篇专门标题为“LER指南”的独立指导文件，但其在多个生物制品监管文档中，已经将内毒素检测中的遮蔽（Masking）、内毒素稳定性、加标回收（Spike Recovery）保留时间（Hold-Time）研究纳入监管预期。
在2012年，FDA发布的 “Guidance for Industry: Pyrogens and Endotoxins Testing — Questions and Answers” 中，就明确讨论了内毒素测试接受标准、方法稳定性测试等内容。在该Q&A指南中，有一段提到样品保存、处理、保留时间的重要性：
一、LER的法规背景：FDA指南与监管逻辑
FDA虽未发布一篇专门标题为“LER指南”的独立指导文件，但其在多个生物制品监管文档中，已经将内毒素检测中的遮蔽（Masking）、内毒素稳定性、加标回收（Spike Recovery）保留时间（Hold-Time）研究纳入监管预期。
在2012年，FDA发布的 “Guidance for Industry: Pyrogens and Endotoxins Testing — Questions and Answers” 中，就明确讨论了内毒素测试接受标准、方法稳定性测试等内容。在该Q&A指南中，有一段提到样品保存、处理、保留时间的重要性：
“Firms should establish procedures for storing and handling（which includes product mixing）samples for bacterial endotoxins analysis using laboratory data that demonstrate the stability of assayable endotoxins content.” 并且还提到，“sampling plan … should consider the potential … impact of in-process hold times.”
在FDA批准的案例中，当样品配方中具有已知的掩蔽潜在因子（如聚山梨酯、EDTA、柠檬酸缓冲体系等）时，审评员会重点审查是否存在内毒素遮蔽，以及对应的缓解方案（Mitigation Strategy），是否提交了保留时间的加样回收数据（Spike Recovery Over Time）。如未充分说明这一点，可能会要求补充资料或延长审评时间，甚至追加风险控制承诺 （Post-Approval Commitments, PAC/PMC）。 如以下的FDA BLA审评资料中，就明确提到了：
FDA BLA Review Letter / Administrative Correspondence — Janssen Biotech, Siltuximab（BLA 125496）：
FDA BLA Review Letter / Administrative Correspondence — Janssen Biotech, Siltuximab（BLA 125496）：
“The effect of hold time on endotoxin recovery should be assessed by spiking a known amount of endotoxin into undiluted drug substance and drug product and then testing for recoverable endotoxin over time. The studies should be conducted using containers of similar composition as those used for drug substance and drug product during hold.”
FDA BLA letter（BLA 761085）：
“Evaluate the effect of hold time on endotoxin detection by spiking a known amount of standard endotoxin （RSE or purified CSE） into undiluted DP and test for recoverable endotoxin over time.”
FDA letter for BLA 761430（2024年）
“Perform a supplemental low endotoxin recovery（LER） study to … examine the effects of hold time on endotoxin recovery … spiked with Reference Standard Endotoxin （RSE）… investigate additional endotoxin detection methods if LER is shown.”
FDA监管逻辑也可解读为：配方越复杂，尤其是生物制品，越应采用基于风险的方法 （Risk-Based Approach） 来评估内毒素检测的稳健性，而不是简单依赖LAL方法的一次性验证或适用性研究 （Method Suitability Test）。换句话说，FDA期望申报方展示在动态条件下（储存、保存、稀释、成分交互作用等）的分析体系是否可靠的“持续信心”。
目前来看，LER已不只是实验室技术问题或“学术讨论问题”，更是成为了监管预期的一部分。FDA在审评过程中，特别是BLA阶段，若配方体系中含螯合剂、表面活性剂等，审评人员可能会要求提交保留时间研究（Hold-Time Study）或加标回收率数据（Spike / Recovery Data），以证明在实际样品中的检测可靠性。这意味着，LER是深刻关系到产品许可审批顺利与否、患者安全保障的重要环节。若我们未将LER风险纳入放行体系和验证验证规划（Validation Plan），将可能面临审批延误或审评问询（Review Deficiency Questions, RFI）。
二、PDA技术报告No.82 （TR-82） 核心要点
为响应行业对LER风险管理的需求，PDA在2019年发布技术报告No.82，系统整理了LER现象背后的机理、推荐的保留时间研究设计方案，以及多种缓解策略的选项。TR-82 的关键点：
◆ 术语与定义
TR-82 提供了关于LER、遮蔽、去遮蔽（Demasking）、加标回收、保留时间的术语定义和应用解释，帮助行业统一理解LER。
◆ LER保留时间研究设计原则
- 推荐设计时间点（Time Points）的选择，例如T0（立即检测）、多日保持（如1日/ 3日/7日/14日等）；
- 支持按时间点顺序方法（Chronological Approach）或反向加标法（Reverse- Spike Method）的研究设计；
- 建议考虑样品容器类型、温度条件、储存介质、加标用标准品（必须使用表征明确的内毒素标准品，如 RSE 或 CSE）；
- 强调保留时间研究虽非 USP方法验证（Method Suitability） 的强制内容，但在BLA提交审评中日益被监管部门要求纳入补充研究中。
◆ LER 机理与影响因素
- TR-82 深入探讨了导致 LER的潜在因子：螯合剂、缓冲体系pH、离子强度、温度条件、保留时间、容器吸附效应、表面活性剂、蛋白与LPS的结合等；
- 报告强调不同来源的内毒素的敏感性不一，因此建议不要只用某一类内毒素标准品（如 NOE），应采用药典接受的标准品（如 RSE 或 CSE）， 以保证检测体系的可比性和接受度。
◆ 缓解/去遮蔽策略
TR-82附录中提供多个案例，讨论样品前处理技术，去遮蔽，如加分散剂、稀释、样品前处理等，以及替代检测方法，如 MAT、rFC，以解决遮蔽问题。
◆ 风险管理与监管趋势
TR-82鼓励企业将LER管理纳入产品生命周期的风险评估控制中，并将保留时间、去遮蔽方法学优化纳入到持续验证 （Lifecycle Verification）中。
三、LER风险控制管理实践建议
通过PDA TR-82与FDA指南的结合解读，以及基于实际的申报案例，提出了LER风险评估、保留实验规划与缓解（去遮蔽）方法学优化的完整框架，也成为行业技术与合规对接的重要桥梁。但到目前为止，还没有一种能够去除LER现象的标准方法或者方案，因此这可能也是FDA或者其他监管机构没有出“LER指南”的正式独立指导文件的主要原因之一。
基于此，对于内毒素LER检测，有以下几点实践建议：
1. 在验证规划阶段（Validation Plan）
主动将LER风险纳入风险评估（Risk Assessment），在验证方案中明确列出保留时间研究（例如 0 h、24 h、48 h、72 h、7 d 或更长）；针对配方体系中可能含有螯合剂（EDTA、柠檬酸缓冲液）、表面活性剂（如聚山梨酯系列）、高蛋白（例如载体蛋白、辅料蛋白）等，设计专项样品前处理（去遮蔽）组作对比研究。
2. 设计并执行加标回收保留时间研究（Spike / Recovery & Hold-Time Study）
使用合适内毒素标准品（如 USP-认可的 RSE 或 CSE），并分别在多个时间点对样品进行加样与回收评估；可考虑采用按时间点顺序反向或正向加标，根据时点数量与资源平衡；同时评估容器材质、温度条件（室温、冷藏、生产条件模拟）等对回收率的影响。
3. 若发现回收率显著下降（如低于预定标准，例如50%或其他内部设定标准）
必须评估是否存在内毒素遮蔽/去遮蔽需求，建议选择合适的前处理试剂、稀释、加盐或金属离子补偿、加分散剂等方法，或考虑采用商业化去遮蔽试剂（如湖州申科前处理试剂盒、去遮蔽试剂）进行优化验证；可将优化后的前处理方案纳入标准操作程序（SOP，并在后续批次和稳定性样品中持续监控回收率（Lifecycle Verification 或 Periodic Review）。
4. 将LER风险管理前移
不应仅关注最终产品，应将保留时间、去遮蔽验证延伸至工艺中间品、储存条件、样品保存、运输、冷藏等环节，建议在生产中设置监控点（in-process Controls），对关键配方工艺段或含有高风险辅料（如含高表面活性剂 /缓冲剂 /蛋白载体）工艺段纳入定期加样回收或监测中（例如定期执行工艺样品的回收率检测）。
5. 与产品申报流程对齐
若产品计划提交国际注册（如FDA、EMA），建议在申报资料（临床/商业许可申请资料）中明确报告 LER保留时间研究方案、去遮蔽方法开发过程与评估结果；并将其归入质量、CMC支持材料中，以增强审评人员对检测方法可靠性的信心，减少审评问询（RFI）风险。
四、总结
LER现象已由学术观察逐步演变为生物制剂质量控制与监管审评中的核心关注点。基于FDA指南和监管思路，以及PDA TR-82的技术框架，我们可以构建从风险识别、验证设计（保留时间& 加标回收）、试剂/方法优化（去遮蔽）、以及贯穿生产生命周期的监控体系，主动应对LER，不仅是确保安全性与合规性需要，更是提升质量体系成熟度和监管申报效率的重要路径。
我们每一个负责QC、方法验证、质量保障（QA）的团队，都将LER管理纳入其制度设计，并持续以科学数据支撑其检测体系的稳健性与合规性，为生成去除LER现象的标准方法或者方案积累大量可靠的数据。
参考文献
TR-82附录中提供多个案例，讨论样品前处理技术，去遮蔽，如加分散剂、稀释、样品前处理等，以及替代检测方法，如 MAT、rFC，以解决遮蔽问题。
◆ 风险管理与监管趋势
TR-82鼓励企业将LER管理纳入产品生命周期的风险评估控制中，并将保留时间、去遮蔽方法学优化纳入到持续验证 （Lifecycle Verification）中。
三、LER风险控制管理实践建议
通过PDA TR-82与FDA指南的结合解读，以及基于实际的申报案例，提出了LER风险评估、保留实验规划与缓解（去遮蔽）方法学优化的完整框架，也成为行业技术与合规对接的重要桥梁。但到目前为止，还没有一种能够去除LER现象的标准方法或者方案，因此这可能也是FDA或者其他监管机构没有出“LER指南”的正式独立指导文件的主要原因之一。
基于此，对于内毒素LER检测，有以下几点实践建议：
1. 在验证规划阶段（Validation Plan）
主动将LER风险纳入风险评估（Risk Assessment），在验证方案中明确列出保留时间研究（例如 0 h、24 h、48 h、72 h、7 d 或更长）；针对配方体系中可能含有螯合剂（EDTA、柠檬酸缓冲液）、表面活性剂（如聚山梨酯系列）、高蛋白（例如载体蛋白、辅料蛋白）等，设计专项样品前处理（去遮蔽）组作对比研究。
2. 设计并执行加标回收保留时间研究（Spike / Recovery & Hold-Time Study）
使用合适内毒素标准品（如 USP-认可的 RSE 或 CSE），并分别在多个时间点对样品进行加样与回收评估；可考虑采用按时间点顺序反向或正向加标，根据时点数量与资源平衡；同时评估容器材质、温度条件（室温、冷藏、生产条件模拟）等对回收率的影响。
3. 若发现回收率显著下降（如低于预定标准，例如50%或其他内部设定标准）
必须评估是否存在内毒素遮蔽/去遮蔽需求，建议选择合适的前处理试剂、稀释、加盐或金属离子补偿、加分散剂等方法，或考虑采用商业化去遮蔽试剂（如湖州申科前处理试剂盒、去遮蔽试剂）进行优化验证；可将优化后的前处理方案纳入标准操作程序（SOP，并在后续批次和稳定性样品中持续监控回收率（Lifecycle Verification 或 Periodic Review）。
4. 将LER风险管理前移
不应仅关注最终产品，应将保留时间、去遮蔽验证延伸至工艺中间品、储存条件、样品保存、运输、冷藏等环节，建议在生产中设置监控点（in-process Controls），对关键配方工艺段或含有高风险辅料（如含高表面活性剂 /缓冲剂 /蛋白载体）工艺段纳入定期加样回收或监测中（例如定期执行工艺样品的回收率检测）。
5. 与产品申报流程对齐
若产品计划提交国际注册（如FDA、EMA），建议在申报资料（临床/商业许可申请资料）中明确报告 LER保留时间研究方案、去遮蔽方法开发过程与评估结果；并将其归入质量、CMC支持材料中，以增强审评人员对检测方法可靠性的信心，减少审评问询（RFI）风险。
四、总结
LER现象已由学术观察逐步演变为生物制剂质量控制与监管审评中的核心关注点。基于FDA指南和监管思路，以及PDA TR-82的技术框架，我们可以构建从风险识别、验证设计（保留时间& 加标回收）、试剂/方法优化（去遮蔽）、以及贯穿生产生命周期的监控体系，主动应对LER，不仅是确保安全性与合规性需要，更是提升质量体系成熟度和监管申报效率的重要路径。
我们每一个负责QC、方法验证、质量保障（QA）的团队，都将LER管理纳入其制度设计，并持续以科学数据支撑其检测体系的稳健性与合规性，为生成去除LER现象的标准方法或者方案积累大量可靠的数据。
参考文献
- FDA Guidance（2012）: Low Endotoxin Recovery（LER）Phenomenon and Endotoxin Masking in Biologics
- USP <1085.1>: Use of the Bacterial Endotoxins Test for Biologics
- PDA Technical Report No. 82 （2018）: Low Endotoxin Recovery
- ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products
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