一项结合速度优化的DNA镜像序列成像新策略实现高效12重超分辨成像
2025-12-04 来源:本站 点击次数:39在生命科学领域，理解细胞分子结构的纳米级细节对揭示宏观生物功能至关重要。然而，传统成像技术如免疫荧光或质谱成像的空间分辨率受限，难以捕捉蛋白质相互作用的分子尺度信息。尽管超分辨显微镜技术如STORM或DNA-PAINT已实现纳米级分辨率，但其多靶标成像能力受限于荧光标记通道数目和成像速度。本文介绍了一项结合速度优化的右旋DNA与左旋DNA（镜像序列）的成像新策略，实现了高效12重超分辨成像。该方法通过简化标记流程，在单蛋白分辨率下对复杂神经元互作网络进行三维测绘，仅需10小时即可完成200×200微米的大视野成像，将传统需数周的实验压缩至一天内完成。
本研究成果由Eduard M. Unterauer、Eva-Maria Schentarra、Isabelle Pachmayr、Taisha Tashrin等共同主导，题为《Left-handed DNA for efficient highly multiplexed imaging at single-protein resolution》，于2025年10月《Nature Communications》正式发表。
重要发现
01左旋DNA-PAINT技术原理与序列优化
研究团队基于右旋DNA-PAINT的速度优化序列（R1-R6），设计并合成了其镜像版本——左旋DNA序列（L1-L6）。这两种序列在结构和化学性质上互为镜像，但具有相同的杂交特异性。通过将6条右旋和6条左旋序列组合，构建出12通道正交探针库，可直接用于Exchange-PAINT工作流程，无需引入次级标记或链置换反应。这种设计显著降低了实验复杂度，避免了对瞬态DNA条形码的依赖，使非专业用户也能轻松实现高性能多重成像。
在DNA折纸纳米结构上进行的验证实验中，左旋序列展现出与右旋序列相当的空间分辨率（亚5纳米）和结合动力学特性。研究人员成功对间距仅15纳米的单个结合位点进行清晰分辨，且序列间无交叉干扰。特别是在5纳米间距的DNA折纸测试中，L1序列实现约1.4纳米的定位精度，证实其分子级分辨能力。
在细胞环境中，团队选取核孔蛋白Nup96、线粒体外膜蛋白Tom20和微管蛋白α-Tubulin作为超分辨成像基准标志物。通过3D成像，不仅分辨出核孔复合体中相距约13纳米的单个Nup96蛋白，还清晰呈现了线粒体膜上Tom20的分布以及直径约30纳米的微管纤维结构。
03结合动力学表征通过DNA折纸和细胞核孔复合体实验，系统比较了12条序列的“亮态”与“暗态”时间分布。尽管右旋序列R2与左旋序列L2在亮态时间上存在差异，但所有序列的整体动力学参数与既往报道的速度优化序列相符，表明左旋DNA-PAINT在保持高速成像的同时不影响探针的结合特异性。
0413重神经元图谱测绘应用
研究团队将这一技术应用于原代海马神经元，绘制了13种蛋白质（12重Exchange-PAINT加Lifeact标记的肌动蛋白）的三维相互作用图谱。在200×200微米视野内，以约12纳米的空间分辨率（定位精度约5纳米）完整捕获了神经元细胞骨架、细胞器及突触蛋白的纳米级分布。实验仅耗时约10小时，相较传统Exchange-PAINT技术（需约一个月）效率提升近百倍。
该图谱首次在单蛋白分辨率下揭示了兴奋性突触（Bassoon、PSD95、VGlut1）与抑制性突触（Bassoon、Gephyrin、VGAT）的分子组成，并发现了一种新型混合突触（Gephyrin与VGlut1共定位）。此外，研究还观察到过氧化物酶体（Pmp70）与高尔基体（Golga5）间的潜在膜接触位点，为细胞器间通讯研究提供了新线索。通过三维渲染，清晰展示了βII-血影蛋白的环状结构、神经纤维丝的分布以及线粒体在轴突和树突中的形态多样性。
创新与亮点
01突破多重成像的速度瓶颈
本研究最大创新点在于将左旋DNA序列引入速度优化DNA-PAINT框架，解决了高阶多重超分辨成像中速度与复杂度难以兼顾的难题。传统多重成像需依赖有限的光谱通道或耗时的探针交换流程，而左-右旋DNA组合将可用序列空间扩展一倍，在不增加光学硬件负担的前提下实现12重并行检测。其成像速度较常规Exchange-PAINT提升两个数量级，使大视野纳米级空间蛋白质组学分析进入“小时级”时代。
由于左旋DNA不易被细胞内核酸酶降解，且与右旋DNA无交叉反应，该技术显著降低了非特异性背景信号。实验流程无需复杂二级标记，仅通过一轮抗体孵育和多轮左/右旋成像链孵育即可完成，极大提升了方法的鲁棒性和可重复性。这种“即插即用”式设计打破了超分辨技术对专业操作人员的依赖，有望推动其在临床诊断中的应用。
03为生物医学研究提供新范式
该技术首次在单神经元尺度同时解析网络连接与分子组成，为研究神经退行性疾病、突触可塑性提供了全新工具。例如，通过对比健康与病变神经元中多种蛋白质的纳米级分布差异，可揭示阿尔茨海默症等疾病早期的结构改变。此外，方法兼容性高，只要具备相应的一级亲和试剂，即可推广至肿瘤微环境、免疫细胞相互作用等研究场景，实现“跨尺度”生物医学成像。
总结与展望
左旋DNA-PAINT技术通过巧妙利用镜像核酸化学，成功打破了超分辨多重成像在通量、速度与易用性之间的平衡瓶颈。其能够在单蛋白分辨率下，以小时级耗时完成复杂
细胞系统的多靶标测绘，为空间蛋白质组学研究树立了新标杆。未来，该技术可与肽段-PAINT、扩增标记等策略进一步结合，将 multiplexing 能力提升至数十甚至上百种靶标。随着更多针对疾病标志物的亲和试剂的开发，这一方法有望在精准医疗领域发挥重要作用，例如用于病理切片中稀有生物标志物的定量分析或药物靶点分布的纳米级评估。尽管技术在标记效率、三维成像深度方面仍有优化空间，但其无疑为生命科学研究者提供了一把解锁细胞纳米世界的钥匙。
声明：本文仅用作学术目的。
Jevdokimenko K, Kowalewski R, Opazo F, Fornasiero EF, Masullo LA, Jungmann R. Left-handed DNA for efficient highly multiplexed imaging at single-protein resolution. Nat Commun. 2025 Oct 2;16(1):8773.
DOI:10.1038/s41467-025-64228-x.