高密度微电极阵列（HD-MEA）相比传统电生理（如膜片钳）或低密度微电极阵列，具备三大核心优势：
🔷 长期、高通量、非侵入式监测神经网络整体活动；
🔷 高时空分辨率捕捉单细胞乃至亚细胞（轴突）水平的电信号及其传播；
🔷 结合电活动进行功能成像，间接获取网络拓扑信息。

本次论文解读分享一个利用HD-MEA高时空分辨率解析复杂生理过程和长期监测动态变化独特优势的典型研究案例，供大家参考。

研究论文的标题为“Development of an innervated human skin equivalent to model nociceptive circuitry in vitro”，由意大利技术研究院（IIT）Paolo Antonio Netti教授研究团队于2025年10月31日在《Biomaterials》期刊（IF₂₀₂₄=12.8）上线。

研究成功开发了一种可以培养在HD-MEA设备芯片上的神经支配人皮肤等效物模型。该模型包含内源性细胞外基质、人施万细胞和分层表皮，可被大鼠背根节感觉神经元完全支配，并形成神经-上皮连接。HD-MEA记录显示，人皮肤等效物与背根神经元的共培养使得背根神经节的自发活动显著增强，且对表皮局部施加的伤害性刺激（辣椒素）产生具有时空特异性的强烈电生理响应，成功在体外复现了体内伤害感受信号从皮肤向感觉神经元的完整传导通路。

HD-MEA技术结合该模型，为体外研究伤害感受环路机制、评估新型镇痛疗法及构建人源感觉疾病模型提供了一个功能强大的高分辨率电生理监测平台。

研究主要结果
本研究首先利用人成纤维细胞构建富含内源性细胞外基质的人真皮等效物，并植入人施万细胞和角质形成细胞，经气液界面培养形成分层表皮，获得完整的人皮肤等效物。随后，将成熟的大鼠背根节神经元网络（培养于HD-MEA上）与该皮肤模型共培养9天，实现神经支配。最后，结合形态学、免疫组化和HD-MEA电生理记录，系统评估模型的神经支配结构、自发电活动及对辣椒素刺激的伤害感受响应。

1、构建富含施万细胞、完全内源性的神经支配人皮肤等效物
研究团队构建了包含人成纤维细胞、施万细胞（human Schwann cell, HSC)）和角质形成细胞的完全内源性人皮肤等效物（innervated human skin equivalent, IHSE）（图1）。H&E染色显示真皮细胞外基质致密，其中嵌有成纤维细胞。免疫荧光证实施万细胞（S-100阳性）位于上皮下方和真皮层内。经气液界面培养后，上皮完全分层和分化，角质形成细胞标志物（基底层的角蛋白14、生发层的p63、棘层的角蛋白10和角质层的兜甲蛋白）表达明确，表明表皮结构完整且功能正常。
 

图1：富含人施万细胞的人皮肤等效物的形态发生。
a) 生成HSC富集HSE的流程示意图。
b) 成熟HSE在Transwell上的照片。
c) 上皮分化过程的详细示意图。
d) 上皮分化浸没阶段结束时HSE的H&E染色（左）和S-100/DAPI免疫标记（右），显示施万细胞位于角质形成细胞和真皮层之间。
e) ALI培养阶段结束时HSE的H&E染色（左）和S-100/DAPI免疫标记（右），显示上皮完全分层，施万细胞位置。
f) ALI阶段结束时HSE的免疫标记，分别显示角蛋白14（基底层）、p63（生发层）和角蛋白10（棘层）、以及兜甲蛋白（角质层）。

2、大鼠背根节神经元在培养过程中形成并收缩
将大鼠背根神经节（rat dorsal root ganglion, R-DRG）神经元接种于HD-MEA上培养13天（图2）。第3天出现明显神经元簇，第8天出现神经突触连接，但第13天网络面积显著收缩。量化分析显示：与第3天相比，第8天和第13天的簇大小分别减少了28%（0.72 ± 0.22）和33%（0.67 ± 0.16）；网络面积在第3天为总MEA面积的0.78 ± 0.13，第8天为0.71 ± 0.11，第13天为0.55 ± 0.23，较第3天显著减少24%。培养第13天时神经元簇尺寸趋于稳定，同时平均放电率达到峰值（0.62 ± 0.32 Hz），被确定为与HSE共培养的最佳起始时间点。
 

图2：R-DRG感觉神经元在HD-MEA系统上的网络演化。
a) R-DRG神经元在HD-MEA上成熟的流程示意图。
b) 第3、8、13天神经元在HD-MEA表面的立体显微镜图像，显示簇缩小和网络面积收缩。
c) （左）归一化的平均簇大小；（右）归一化的平均网络面积，定量证实收缩趋势。
d) （左）玻片上R-DRG神经元簇的明场图像；（中）TRPV1和DAPI荧光成像；（右）β-微管蛋白-3和DAPI荧光成像，显示神经元网络的三维结构及痛觉感受器标记表达。

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本研究中使用的高密度微电极阵列（HD-MEA）设备由瑞士MaxWell Biosystems公司研发生产。HD-MEA技术在8.1 mm²芯片表面集成26,400个电极（密度3,259 electrodes/mm²，间距17.5 μm），将电信号采集的空间分辨率提升至亚细胞层级，可捕获样本的每一个神经元电信号。不仅支持急性脑切片、视网膜组织等生物样本的急性实验记录，更支持体外培养神经元、类器官、心肌细胞的长时程检测。

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3、IHSE形态学特征证实神经-上皮连接形成
免疫荧光和3D重建显示，R-DRG神经元的轴突成功穿过1毫米厚的HSE真皮层，到达表皮层，并形成分支（图3-4）。在表皮层中检测到β-微管蛋白-3信号，深度可达100微米，表明神经末梢已到达上皮。观察到神经末梢在接近表皮时分支成更细的末端，形态类似体内游离神经末梢（free nerve endings-like structures, FNELS)）。在横切面中，β-微管蛋白-3信号清晰地出现在真皮-表皮连接处和真皮内部，证实了神经突在真皮内的生长以及与表皮的连接。S-100标记证实施万细胞也浸润到HSE真皮层中。

图3：与HD-MEA集成的IHSE的形态学特征。
a) HD-MEA上IHSE的照片，标出观察区域。
b) 三个观察区域的示意图。
c) 从顶端开始的IHSE上部95微米Z扫描（左）及绿色信号深度编码（右），显示神经元标记从深层到达表层。
d) IHSE侧面132微米深度的Z扫描（左）及绿色信号深度编码（右），显示支配性神经突向顶端分支形成FNELS。

图4：神经支配HSE横切面的共聚焦和多光子成像。
a) 分析样本横切面的示意图。
b, c) β-微管蛋白-3/DAPI免疫标记及SHG胶原成像，显示真皮内和真皮-表皮连接处的神经突（类似FNELS）。
d, e) S-100/DAPI免疫标记及SHG胶原成像，证实施万细胞位于真皮-表皮连接处和真皮层内。
f, g, h) 另一样本的β-微管蛋白-3/DAPI免疫标记，进一步证实神经突存在于真皮层并接近上皮角质形成细胞核，形成神经-上皮连接。

4、IHSE表现出显著高于2D培养的自发电活动
电生理记录显示，IHSE共培养显著增强了神经元网络的自发性活动（图5-6）。在共培养第3、6、9天（对应总培养第16、18、22天），IHSE模型的平均放电率（分别为1.00 ± 0.27 Hz， 0.80 ± 0.18 Hz， 0.72 ± 0.20 Hz）均约为对应时间点2D DRG培养（0.48 ± 0.04 Hz， 0.34 ± 0.01 Hz， 0.47 ± 0.02 Hz）的2倍，差异显著。同时，IHSE的活性电极面积也显著增大（分别为2.5倍， 6.14倍， 5.07倍）。此外，利用Axon Tracking模块提取的形态功能参数（如总轴突长度从第11天的489.80 ± 169.33 μm显著增加至第22天的3777.98 ± 1743.19 μm）表明HSE共培养促进了轴突的生长和网络的成熟。

图5：HSE对R-DRG神经元网络自发电活动的影响。
a) （左）IHSE图像与电生理活动热点叠加；（中、右）电极记录簇的同步活动和尖峰传播示例。
b) （左）2D DRG模型与3D DRG+HSE模型平均放电率随时间演化；（右）两者活性面积随时间演化，显示HSE共培养显著增强自发活动。

图6：HSE对R-DRG神经元网络自发电活动的影响——形态功能分析。
a) 第11、16、18、22天Axon Tracking分析图像，显示检测到的轴突。
b) Axon Tracking图像与IHSE显微镜图像叠加，证实检测到的活性神经元与HSE接触。
c-f) 检测到的神经突在传导速度、分支长度、距起始点最长距离和最长潜伏期方面的分布直方图。

5、IHSE对辣椒素刺激表现出特异性伤害感受响应
在IHSE表皮顶端局部施用50 μM辣椒素溶液，可诱发特异性时空电响应（图7-8）。MEA记录显示，给药后神经元放电率立即增加，平均放电率在给药后初期（0-300秒）比自发活动高出70%（P < 0.01），同时活性通道数增加13%（P < 0.05）。放电率在给药后300-600秒内仍保持高位（比自发活动高63%， P < 0.001）。然而，在给药600-900秒后，放电率和活性通道数均急剧下降（放电率降低52%， 活性通道数减少65%， P < 0.01）。对照实验（共培养仅24小时，未形成充分神经支配）显示，辣椒素局部给药后响应延迟（约300秒后）且幅度显著低于成熟IHSE（P < 0.05），而全身给药虽立即响应但持续时间短。这证实了成熟IHSE中功能性神经-上皮连接对于完整伤害感受传导的重要性。

图7：IHSE对辣椒素诱发的伤害感受电活动响应。
a) 辣椒素局部给药的实验示意图。
b) 单个电极记录的轨迹，显示给药后尖峰数量立即增加。
c) 检测到的尖峰波形，呈树突区特征的正向尖峰。
d) 所有电极检测到的尖峰数随时间演化示例图，显示给药后尖峰数骤升并持续约600秒后下降。
e) 对应样本的通道活动点阵图，显示给药后新通道激活，随后通道失活。
f, g) 按300秒间隔统计的平均检测尖峰数和平均活性通道数条形图，量化显示给药后的显著增强及后期的抑制。

图8：辣椒素诱发活动期间通道的映射、分类和定量。
a) 辣椒素给药后的参考时间轴，定义自发活动（SA）、早期诱发活动（EA）、中期诱发活动（MA）和晚期诱发活动（LA）。
b) IHSE图像、活性神经元簇的Axon Tracking及辣椒素实验中记录电极位置的叠加图。
c) 图b黑色框区域的放大，显示电极活动状态变化（红色：新激活；蓝色：失活；灰色：持续激活）。
d) 各时间间隔比较的矩阵，显示平均激活电极数、持续活性电极数和失活电极数及其标准差。

研究总结
本研究首次将先进的HD-MEA电生理平台与复杂的神经支配人皮肤等效物模型相结合。HD-MEA技术的引入，使得研究者能够以亚细胞分辨率、长期（数天至数周）、同时记录数百个位点的电活动。

首先，高密度与非侵入性使其能长期（超过20天）稳定记录整个神经网络的自发和诱发活动，避免了膜片钳的机械损伤和单次记录局限。其次，高时空分辨率使其能精确定位辣椒素刺激后电活动的起源和传播路径，首次在3D皮肤模型中可视化了伤害信号从表皮向神经元的传递过程。再者，其高通量并行记录能力（同时监测上千个位点）提供了全面的网络活动视图，量化了共培养后放电率、活性面积及轴突参数的全局性变化，有力证明了HSE对神经网络的调制作用。最后，电信号驱动的形态分析功能（Axon Tracking）在组织不透明的情况下，依然能提取出神经网络的关键形态参数，体现了其功能与形态分析结合的优势。

综上所述，HD-MEA是将复杂3D组织模型的功能分析提升到高时空动态解析水平的理想工具。

参考文献
Bellantoni D, Casale C, Mazio C, et al. Development of an innervated human skin equivalent to model nociceptive circuitry in vitro. Biomaterials. 2025 Oct 31;328:123808. doi: 10.1016/j.biomaterials.2025.123808.