百日咳毒素的分子量范围在9-28kDa之间，各亚基通过非共价键连接形成稳定的金字塔形结构。其中，S1亚基（也称为A启动子）是毒素的活性中心，具有NAD+糖基水解酶和ADP-核糖基转移酶活性。单独的A启动子能够将NAD+的ADP核糖基团转移到Gαi、Gαo或Gαt家族G蛋白的α亚基上。而B寡聚体则负责识别并结合细胞表面的特异性受体（包括TLR4和糖蛋白Ib等蛋白的多糖残基），通过受体介导的内吞作用引导整个毒素分子进入细胞。

进入细胞后，百日咳毒素经历一个复杂的活化过程。它通过胞内体途径和高尔基体复合物进行逆向转运，最终进入内质网。在那里，A启动子从PTX上解离并穿透内质网膜，进入细胞质开始其酶促活动。这一精巧的分子机制使得百日咳毒素能够准确地靶向细胞内部的关键信号调节系统，特别是异三聚体G蛋白通路。

百日咳毒素的生化作用机制主要体现在它能够催化G蛋白α亚基的ADP-核糖基化。具体来说，它的目标主要是Gi、Go和Gt等异三聚体鸟嘌呤核苷酸调节蛋白的α亚基。这一修饰阻止了G蛋白异源三聚体与受体的正常相互作用，使它们无法完成信号转导功能。由于Gα亚基持续处于与GDP结合的非活性状态，导致下游的腺苷酸环化酶无法失活，K+通道无法正常开启。这种对于细胞信号通路的干扰是百日咳毒素多种生理效应的分子基础，同时也成为了科学家研究G蛋白信号转导的重要工具。

值得注意的是，不同细胞类型对百日咳毒素的敏感性存在差异，因此在实验设计中需要优化毒素的使用浓度和作用时间。根据研究报道，在CHO细胞实验中，产生阳性反应（CHO细胞簇集生长模式）所需PTX的最低浓度可低至0.03ng/ml。此外，百日咳毒素在腺苷酸环化酶实验中表现出高效的催化活性，依照Wolff等人的方法测量，其腺苷酸环化酶活性可达9 picomoles/min/μg。这些特性使百日咳毒素成为研究细胞信号机制的不可或缺的工具。

百日咳毒素在EAE模型中的作用机制是多方面的：它通过改变血脑屏障的通透性，促进炎症细胞进入中枢神经系统；同时调节免疫细胞的功能，偏向于促炎性Th1和Th17细胞的分化，抑制抗炎性Th2细胞反应。研究发现，PTX驱动髓样细胞产生IL-1β，这是初始T细胞分化为致病性Th1/Th17细胞的先决条件。这种免疫调节功能对于打破自身抗原的免疫耐受，建立稳定的自身免疫反应至关重要。

除了EAE模型，近期研究还探索了百日咳毒素在其他疾病模型中的应用。例如，一项2023年发表在《青海科技》的研究表明，百日咳毒素联合卡介苗可以成功诱导CD-1小鼠产生持续性抑郁样行为，从而建立一种新型抑郁症动物模型。该研究发现，与单独使用低剂量卡介苗相比，PTX联合处理显著增强了小鼠的行为绝望状态，降低了探索性行为和自发运动，同时促进了中枢神经炎症和外周炎症因子（如IL-1β、IL-6、IFN-γ等）的释放。这种模型表现出至少持续28天的抑郁表型，为抗抑郁治疗研究提供了宝贵的时间窗口。

在疫苗生产过程中，需要确保毒素经过适当处理，降低其毒性而保留免疫原性。目前存在两种主要的脱毒方法：化学脱毒和遗传脱毒。化学脱毒使用甲醛或戊二醛等化学试剂处理毒素，而遗传脱毒则是通过对PTX结构基因进行定点突变来实现。研究表明，遗传脱毒的PTX在安全性和免疫原性方面优于化学脱毒的PTX，这可能代表未来疫苗发展的方向。

在疫苗质量控制中，CHO细胞簇集试验被广泛应用于检测百日咳毒素的残余毒性。该方法的原理是PTX会引起中国仓鼠卵巢（CHO）细胞出现特殊的簇集生长模式，通过观察这种形态变化可以灵敏地检测PTX的生物学活性。研究比较了不同来源的CHO细胞对PTX的敏感性，发现来自ATCC的CHO细胞对PTX最为敏感。此外，小鼠体内检测法（包括小鼠组胺致敏试验和小鼠白细胞增多试验）也常用于评估PTX的毒性，研究表明CHO细胞簇集法与这些体内检测方法之间存在一定的相关性。

• 首先，需要制备百日咳毒素工作液。常见的PTX商品通常以冻干粉形式提供，含有氯化钠和磷酸钠缓冲盐。使用前应用无菌缓冲液重构，并分装保存于-20°C。避免反复冻融，以防止蛋白变性失活。
• 在进行细胞实验时，通常需要在无血清培养基中加入100-200ng/ml的PTX，预处理细胞4-24小时（取决于细胞类型）。例如，在研究GPCR信号通路时，科学家通常使用50-100ng/ml的PTX预处理HEK293T细胞16小时，以有效抑制Gi蛋白信号。值得注意的是，不同细胞系对PTX的敏感性存在差异，建议通过浓度梯度实验确定最佳处理条件。
• PTX处理效果的验证有多种方法。最直接的是检测cAMP水平的积累，因为Gi蛋白的主要功能是抑制腺苷酸环化酶，PTX处理应解除这种抑制，导致基础cAMP水平升高。此外，还可以通过Western blot检测G蛋白α亚基的ADP-核糖基化，或使用PTX催化的ADP-核糖基化实验直接测定其活性。

1. 首先，在诱导当天，给小鼠（通常为C57BL/6或SJL品系）皮下注射含有所需自身抗原（如MOG35-55肽）的完全弗氏佐剂乳化液。
2. 随后，在免疫当天（第0天）和48小时后（第2天），通过尾静脉或腹腔注射200-400ng PTX（溶于100-200μl PBS）。有些实验方案可能会在后续时间点追加PTX注射，以增强疾病发生率和发展程度。

在抑郁症动物模型研究中，PTX的应用方法有所不同。一项2023年的研究采用了百日咳毒素联合卡介苗的方案：首先给CD-1小鼠注射0.2mg/kg的PTX，一周后注射低剂量的卡介苗（1×10^6 CFU）。这种联合处理成功诱导出了持续性的抑郁样行为，包括悬尾试验中不动时间增加、开场实验中运动距离和探索行为减少等。

使用PTX建立自身免疫疾病模型时需注意：

• PTX的剂量、注射时间点和注射途径都会影响模型的表现；
• 动物品系、年龄和饲养环境也会影响对PTX的敏感性；
• 应设立合适的对照组，包括仅接受抗原免疫、仅接受PTX处理以及完全未处理的对照组，以正确解读实验结果。

• CHO细胞簇集试验：是检测PTX生物活性的灵敏方法。具体步骤包括：将来自ATCC的CHO细胞接种于96孔板，加入系列稀释的待测样品，37°C培养48-72小时后，显微镜下观察细胞簇集现象。产生阳性簇集反应的最低PTX浓度可低至0.03ng/ml。这种方法适用于疫苗纯化过程中的中间品控制和最终成品检验。
• 小鼠体内法：包括小鼠组胺致敏试验和小鼠白细胞增多试验。前者通过检测小鼠对组胺挑战的敏感性来评估PTX活性，后者则通过计数外周血白细胞数量变化来反映PTX的生物学效应。研究表明，这两种体内检测方法结果之间存在显著的正相关（r=0.881），而CHO细胞簇集法则与体内法呈负相关。

现代疫苗研发趋势正在从化学脱毒转向遗传脱毒的PTX。遗传脱毒是通过对PTX结构基因进行定点突变，降低其毒性而保留免疫原性。这种方法的优点是避免了化学处理可能导致的表位破坏，从而提供更保护性的免疫反应。然而，即使转向遗传脱毒的PTX，目前的百日咳疫苗仍不能完全防止百日咳鲍特菌感染，开发具有长期免疫力并能防止感染的新型疫苗仍是未来研究的重点。

未来百日咳毒素的研究方向可能包括开发特异性更高的变异体，能够针对特定G蛋白亚型而不影响其他相关蛋白；探索PTX在新型疾病模型中的应用，如神经退行性疾病或代谢性疾病模型；以及优化遗传脱毒PTX疫苗，提供更安全、更有效的百日咳免疫保护。

注意事项：
尽管百日咳毒素在科学研究中价值巨大，但使用时必须注意生物安全。PTX属于警告级危险品，可能引起眼睛和皮肤刺激，甚至器官毒性。操作时应佩戴适当的个人防护装备，包括护目镜、手套和防护服，并在专门的细胞培养实验室中进行，确保安全操作的同时，也保证实验结果的准确性和可重复性。通过深入了解百日咳毒素的特性和应用方法，研究人员可以更好地利用这一强大工具，推动生命科学和医学研究的进步。