本文要点：高性能NIR-II荧光团（1000–1700 nm）的分子设计面临水性稳定性差、量子产率低及肿瘤对比度不足等关键挑战。本研究通过共价整合亲水性花菁核心（Cy-NIR-II-NH₂），构建代际可调的聚（L-赖氨酸）树状大分子（Cy-NIR-II-Gx）。该树状结构抑制H-聚集并隔离水相淬灭，实现24.3倍量子产率提升（水中达0.802%）及48小时光照后>83%的光稳定性保留。这些突破支持深层组织穿透与高对比度血管/淋巴成像，在特定场景中超越临床批准的吲哚菁绿（ICG）。进一步实验表明：Cy-NIR-II-G8经皮内或静脉给药后，对皮下4T1乳腺肿瘤具有优异靶向蓄积性——持续7天的瘤正比>5，满足精准切除的临床导航标准（罗斯判据），术中切缘勾勒明确，切除后信号近完全消除。此分子工程策略有效攻克NIR-II荧光团核心难题，展现重大临床转化潜力。

方案1. 用于深部生物成像应用的亲水性NIR-II菁树状大分子（Cy-NIR II Gx）的设计和合成策略

本研究报道新型NIR-II花菁染料（Cy-NIR-II-NH₂）的理性设计与合成，其伯胺基团可增强水溶性并便于功能化修饰（方案1）。通过L-赖氨酸单体的迭代共价偶联，构建了结构精准可控的代际可调聚赖氨酸树状大分子（Cy-NIR-II-Gx）。精准代际调控（G0至G8）有效抑制了Cy-NIR-II-NH₂在水相中的H-聚集，并通过树状外壳的刚性隔离效应显著降低水分子碰撞导致的非辐射弛豫，同步提升溶解性、荧光亮度与光稳定性。进一步在高分辨率血管成像及淋巴显影中验证其生物医学价值，最终实现原位4T1乳腺肿瘤的荧光导航精准切除，术中切缘清晰勾勒。

图1. 水溶性易改性NIR-II菁染料的合成与光物理表征

基于2-甲基苯并[cd]吲哚衍生物与聚次甲基桥链构建亲水性D-π-A骨架，本研究设计出新型NIR-II花菁染料（图1a）。以苯并[cd]吲哚-2(1H)-酮为起始物，通过格氏加成与克脑文格尔缩合等关键步骤高效合成，成功精准安装双伯胺基团——该步骤极具挑战性（核心结构与末端官能团易降解）——从而增强水溶性并支持胺反应性连接臂修饰。

Cy-NIR-II-NH₂光物理表征显示（图1b）：980 nm激发下，DMSO中最大吸收峰≈990 nm（摩尔吸光系数ε=1.36×10⁵ M⁻¹ cm⁻¹），发射峰1044 nm且谱带覆盖1000-1350 nm（延伸至NIR-IIa区），证实NIR-II成像能力。相较于多数NIR-II染料水溶性差的问题，Cy-NIR-II-NH₂溶解性与临床批准药物ICG相当，优于商用染料IR-26/IR-1048（图1c,）；其水溶液在800 nm处出现强吸收峰，归因于疏水苯并[cd]吲哚-聚次甲基骨架通过面对面堆叠形成H-聚集物——此为平面花菁染料水相特征行为。

通过TDDFT计算（B3LYP/6-31+G(d)水平）对比Cy-NIR-II-NH₂与ICG（二者结构相似）的原子排布影响（图1d）：两染料HOMO轨道均分布于苯环原子，能级相近；差异在于ICG的LUMO仅少量分布于苯并[e]吲哚环，而Cy-NIR-II-NH₂的LUMO离域于整个共轭链致能级显著降低。更低的S0-S1激发能与更高重组能验证其相对ICG的红移趋势，振子强度与高吸光系数吻合。Cy-NIR-II-NH₂辐射衰变速率较低导致量子产率（QY）弱于ICG，但理论证实两染料S1激发均主要源于HOMO→LUMO跃迁——在LUMO主要分布的共轭聚次甲基链周围构建隔离微环境，可有效阻断水分子相互作用，减少非辐射能量转移，从而提升水相荧光QY。

图2. 树状Cy-NIRⅡ的合成及光物理性质

使Cy-NIR-II-NH₂与Boc保护赖氨酸五氟苯酯反应生成第一代树状前体，经Boc脱保护制得Cy-NIR-II-G1（图2a）。通过赖氨酸偶联（Boc-Lys(Boc)-OPFP）与脱保护循环迭代，逐级合成高阶树状大分子（Cy-NIR-II-Gx），最终获得第八代产物Cy-NIR-II-G8。所有结构经高分辨质谱/MALDI-TOF-MS及核磁严谨表征（图2b），实验值与理论预测高度吻合，证实各代结构完整性。HPLC分析显示单一尖锐峰（图2b），保留时间随代际升高系统性缩短（G0:18.5分钟→G8:10.4分钟），归因于累积表面氨基增强的分子极性——该单峰洗脱特征确证无结构缺陷及副产物，保障生物医学应用可重复性。凝胶渗透色谱（GPC）进一步验证单分散性：保留时间随代际增加而降低（G4:16.5分钟→G8:14.3分钟），符合分子量增大导致的流体动力学半径扩张；多分散指数（PDI=1.030–1.078）证实分子量分布均一。透射电镜（TEM）显示Cy-NIR-II-G8为单分散球形纳米粒（直径14.4±0.4 nm，高斯拟合，图2d）；动态光散射（DLS）测得流体动力学直径≈20 nm（图S33），归因于水化溶剂化效应。综上，该NIR-II树状大分子具备结构精准、尺寸可调及优异单分散性，彰显其作为可重复性生物医学制剂的显著潜力。

随后探究树状大分子在水溶液中的光学特性：随着树状大分子生成量的增加，吸收最大值逐渐红移从≈800 nm（G0）红移至960 nm（G2）后趋于稳定（图2e），所有代际均保持≈10⁵ M⁻¹ cm⁻¹的高吸光系数。此红移归因于树状结构表面亲水性增强削弱疏水作用，从而解离H-聚集体——代表一种抑制水相H-聚集的创新分子工程策略。荧光特性亦呈代际依赖性：随代际升高，发射强度持续增强（图2f），量子产率（QY）从0.033%（G0）提升至0.802%（G8），增幅达24.3倍（图2g）。该QY值显著超越IR-26等参照染料及水溶性NIR-II染料（如CH-1055-PEG），NIR-II成像下水溶液亮度增强直观验证此效应（图2h）。

光稳定性对生物医学应用至关重要。花菁染料的聚次甲基桥链易受单线态氧（¹O₂）介导的光氧化切割，而树状大分子的聚赖氨酸（PLL）封装形成空间位阻屏蔽，阻断染料核心与¹O₂接触。短期激光照射下，Cy-NIR-II-G8溶液保持稳定荧光强度与成像亮度（图2i,j），性能优于ICG；低代树状分子（G0-G2）亦展现微弱光降解。48小时可见光照射实验进一步验证：ICG降解率达87.2%，而Cy-NIR-II-G8仅降低17.8%（图2k）。低代类似物因H-聚集体包埋荧光团限制¹O₂接触而维持高稳定性；高代样品虽解聚削弱此效应，但PLL封装通过空间排斥氧化物质实现补偿。此双机制协同作用（聚集保护与大分子屏蔽）印证了水相中树状结构的代际演化规律。

Cy-NIR-II-G8集高NIR-II荧光亮度、精准结构控制与卓越光稳定性于一体，为破解NIR-II荧光团水相稳定性与光学性能的固有矛盾提供了有效策略。

图3. 模拟组织模型的深部组织穿透评估

荧光探针的组织穿透能力决定着活体成像效能。本研究利用NIR-II荧光长发射波长带来的深层光子穿透优势，通过定制InGaAs相机系统在1%脂乳仿体中对Cy-NIR-II-Gx树状分子进行穿透深度定量评估（图3a）。垂直浸入的含树状分子溶液毛细管经激光激发后，呈现代际依赖性穿透特征：基于低代树状分子的显著H-聚集效应及G4代起量子产率（QY）的跃升（图2g），选取G4-G8（980 nm激发）与吲哚菁绿（ICG，808 nm激发）对比分析。

随着深度增加，所有荧光信号均衰减且毛细管轮廓模糊，但仅Cy-NIR-II-G8在6 mm深度仍呈现清晰边缘（图3b）。通过截面强度分布与高斯拟合定量，以信背比（SBR）>2.0且可分辨毛细管结构的最大深度定义为穿透深度：Cy-NIR-II-G8达6 mm，显著优于低代树状分子（4-5 mm）及ICG（3 mm）（图3c）。在>4 mm深度，树状分子半高宽（FWHM）保持稳定，而ICG从3 mm起显著展宽（图3d）。

荧光强度衰减曲线的指数拟合显示，树状分子光学衰减系数（τ）随代际升高系统性降低（G4:0.7955 → G8:0.5089），显著低于ICG（0.8974）（图3e）。此衰减减弱源于双重机制：① 瑞利定律主导的光子散射减少——较长NIR-II发射波长（1000-1350 nm）最小化散射事件；② 代际依赖性QY提升增强信号补偿，G8的高QY通过增加光子通量抵消传播损耗。Cy-NIR-II-G8因此在纳摩尔浓度下实现卓越组织穿透与高对比度成像，确立为深层组织NIR-II生物成像的理想探针。

图4. 树状Cy-NIR-II分子 G8与ICG的NIR-II血管造影

近红外荧光成像是心血管疾病（CVD）诊疗的关键技术，其深层组织分子可视化能力可灵敏检测高风险动脉粥样硬化斑块成分（脂质、炎症标志物）——这些结构成像（如CT/超声）无法穿透血液散射揭示的特征，却是心血管不良事件的核心预测因子。基于此，研究者评估了Cy-NIR-II-G8的活体空间分辨率：BALB/c裸鼠静脉注射后实时NIR-II成像显示（图4a），5秒内荧光精准定位尾静脉；10秒经静脉回流至心腔；15秒颈动脉全身扩散；20秒部分肝蓄积；60秒完成全身血管高清成像。1分钟内实现从局部静脉到全身血管的快速可视化，满足临床快速诊断需求。

在脑、颈、腹、后肢四部位与ICG对比证实Cy-NIR-II-G8的血管成像优势（图4b-e）：高斯拟合显示其信背比（SBR=1.27-1.81）显著高于ICG（1.12-1.51），半高宽（FWHM=0.367-0.664 mmvs ICG's 0.606–0.847 mm）更窄。即使在厚组织颅骨区域仍可分辨血管，而ICG因短波长散射严重且肝摄取快完全失效。Cy-NIR-II-G8注射后血管信号清晰维持超1小时，凸显其长循环稳定性。该探针仅需20 nmol剂量、0.2 W cm⁻²激光功率及≤100 ms曝光，即可在微创条件下实现高对比度血管成像。其卓越性能源于三大本质特性：快速全身分布与稳定循环动力学、NIR-II窗口内散射抑制、高量子产率——这些协同效应使Cy-NIR-II-G8成为临床实时影像导航介入治疗的理想制剂。

图5. 树状Cy-NIR II- G8的体内淋巴NIR-II成像和肿瘤蓄积

前哨淋巴结（SLN）检测技术可实现选择性切除，规避了为预防转移进行全淋巴结清扫术引发的淋巴水肿等并发症。当前SLN定位通常依赖放射性同位素和/或蓝染料识别最可能转移的淋巴结，但存在明显局限：放射性同位素存在安全隐患，而蓝染料在可见光窗口下组织穿透性差。近红外（NIR）导航系统凭借更高淋巴结定位精度和更小切口，可优化术中引导并加速术后恢复，但NIR-I光学成像仍面临光漂白、组织自发荧光及探测深度不足的挑战。

为评估Cy-NIR-II-G8的SLN成像性能并验证NIR-II荧光团优势，在荷4T1肿瘤的BALB/c裸鼠双侧后爪皮内注射Cy-NIR-II-G8或吲哚菁绿（ICG）。荧光成像显示：Cy-NIR-II-G8注射后2小时内即可清晰追踪淋巴结间集合淋巴管、坐骨淋巴结及腘淋巴结（图5a）；8小时后淋巴管信号减弱而淋巴结荧光持续，肿瘤区域出现蓄积；48小时肿瘤信号达峰值并维持至72小时（图5c）。ICG虽可检测淋巴结，但无法分辨淋巴管。横向血管高斯分析证实Cy-NIR-II-G8凭借NIR-II窗口散射减弱，信背比（1.41 vs ICG 1.18）更高、半高宽（0.361 mm vs 0.619 mm）更窄（图5b）。

Cy-NIR-II-G8通过皮内注射实现高对比度淋巴系统成像及长效肿瘤滞留，这归因于其增强的NIR-II量子产率与光稳定性。上述特性为长期观测（如影像导航手术）提供了关键技术支撑。

图6. 树状Cy-NIR II- G8的体内肿瘤聚集和NIR-II图像引导手术

为评估Cy-NIR-II-G8在肿瘤长效监测与精准切除导航中的整合效能，对4T1荷瘤小鼠静脉注射该制剂并持续NIR-II荧光追踪，最终实施影像引导肿瘤切除（图6a）。树状分子经优化的流体动力学直径规避了肾快速清除，同时通过增强渗透滞留（EPR）效应及转胞吞介导的肿瘤内渗实现纳米粒靶向递送（图6b）。肿瘤荧光强度随时间持续升高，注射48小时达峰值瘤正比（T/NT）>5，并维持超7天。该持续信号超越罗斯判据阈值（SBR=5），实现清晰切缘勾勒（图6f）。

注射7天后，基于Cy-NIR-II-G8的强NIR-II信号实施影像导航切除：术中瘤-正常组织边界分明（图6d），切除后荧光降至肌组织本底水平（图6e），定量分析显示瘤正比从5.10降至1.13（图6f）。注射48小时生物分布证实肿瘤特异性蓄积，脾肝仅见微弱信号（图6g,h），瘤肝比>2.5。此靶向蓄积特性显著区别于传统NIR-II荧光团（主要富集于肝脾网状内皮系统）。该研究确立Cy-NIR-II-G8为一体化纳米平台：凭借尺寸优化的体内分布特性提供符合临床导航标准的持续对比度，集肿瘤长效监测与精准切除导航功能于一体。

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本研究首次创造性构建了以近红外二区花菁染料（Cy-NIR-II-NH₂）为核的聚L-赖氨酸树状大分子（Cy-NIR-II-Gx）。该设计在保留花菁染料本征NIR-II光学特性的同时，通过隔离水环境的干扰确保胶体稳定性。代际生长赋予可编程光物理特性：树状枝接增强分子分散性，空间位阻屏蔽破坏H-聚集（吸收红移至960nm），协同将荧光量子产率提升24.3倍（水中达0.802%）并实现卓越光稳定性（48小时光照后信号保留>83%）。优化后的Cy-NIR-II-G8兼具NIR-II发射与优越肿瘤靶向蓄积能力，达成深层组织穿透（仿体6mm，两倍于ICG）及亚0.4mm血管分辨率，支撑多功能生物成像：实时血流动力学追踪、高对比度淋巴显影、持续瘤正比>5长达7天的肿瘤长效监测。其符合精准肿瘤切除的临床导航标准（罗斯判据，SBR=5），经清晰切缘勾勒与切除后信号近完全消除验证（瘤正比≈1.13）。该可编程树状拓扑结构以尺寸可调和表面氨基丰富为特征，支持定制化细胞内核化，并为靶向分子（如抗体、多肽）偶联提供多功能位点，推进影像导航治疗。此项工作通过融合NIR-II花菁光子学与树状纳米技术，建立了突破NIR-II染料"溶解性-亮度-稳定性"平衡困境的多功能诊疗平台，连接术中导航与术后监测，推动精准癌症医学发展。

参考文献

He, Bo, et al. "Dendritic NIR‐II Cyanines Enable Deep Imaging and Precise Surgery." Small (2025): e09826.

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动物活体荧光成像系统 - MARS 

In Vivo Imaging System

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