光片显微镜融合组织透明化技术实现小鼠全器官水平高分辨率成像
2026-01-15 来源:本站 点击次数:178本研究开发了一种创新的相关成像方法，成功将宏观心脏电生理学数据与三维微观心室重建技术相结合，旨在揭示纤维化组织在心律失常发生中的具体作用。通过应用光片显微镜和组织透明化技术，研究人员对desmoglein-2突变小鼠模型进行了全器官水平的高分辨率成像，发现纤维化区域表现出频率依赖性的电传导行为：低频刺激时传导正常，而高频刺激则导致传导阻滞，从而促进折返性心律失常。这一发现不仅深化了对致心律失常性心肌病机制的理解，还为个性化心脏电生理模型提供了新思路。
本研究的核心贡献者包括Francesco Giardini、Leonardo Sacconi、Camilla Olianti、Gerard A. Marchal等作者；研究成果以题为“Correlative imaging integrates electrophysiology with three-dimensional murine heart reconstruction to reveal electrical coupling between cell types”的论文形式，于2025年10月在《Nature Cardiovascular Research》期刊上线发表。
重要发现
01实验设计与多模态光学成像方法
研究首先通过Langendorff灌流系统分离小鼠心脏，并利用电压敏感染料（di-4-ANBDQPQ）进行光学映射，以记录左心室游离壁的动作电位形态与传导动力学。实验设置了低频（5 Hz）和高频（10–15 Hz）的心尖起搏协议，以模拟不同生理状态下的电活动。完成功能检测后，心脏经SHIELD组织透明化处理，使其在保持结构完整性的前提下实现光学透明。随后，采用定制的光片显微镜（mesoSPIM）进行全心室三维扫描，成像体素分辨率达3.25 μm × 3.25 μm × 3.1 μm，最终重采样为各向同性的6 μm³体素，从而实现了从宏观解剖结构到微观心肌细胞排列的多尺度重建。这一技术组合克服了传统成像中大体积组织高分辨率数据的获取难题，为后续分析提供了坚实基础。
AP动力学和传导的功能表征
02电生理学特征的定量分析在对照组（CTRL）和DSG2突变模型小鼠中，光学映射数据显示：DSG2心脏的动作电位峰值时间（TTP）延长，且高频刺激下复极化时间（APD50、APD70、APD90）无显著变化，但传导速度在高频时明显下降。尤为重要的是，DSG2心脏在高频起搏时出现波前变形（以角度分散度衡量），而对照组则保持均匀传导。通过激活地图直观展示了DSG2心脏在高频刺激下波前沿纤维化区域扭曲的现象，说明结构异常如何直接导致功能紊乱。这些发现提示，纤维化并非单纯的电惰性屏障，而是动态调制传导的关键因素。
使用双光子显微镜验证散射信号
03三维心室重建与纤维化量化基于光片显微镜采集的荧光信号（标记心肌）和散射信号（标记胶原纤维），研究团队将心室组织分割为三类：健康心肌（MYO）、致密纤维化（CF）和非致密纤维化（NCF）。通过三维形态计量学分析，发现DSG2心脏中CF和NCF的体积占比显著高于对照组，且纤维化主要分布于左心室游离壁的中层心肌区域。图中进一步展示了整个心室的三维重建结果，其中散射信号与胶原分布的高度一致性经组织学验证（如Masson三色染色和双光子成像），证实了成像数据的可靠性。此外，通过分析心肌细胞取向（基于荧光梯度张量计算），研究还重建了全心室的纤维架构，但未发现细胞排列紊乱与纤维化空间分布的直接关联。
所有纳入的DSG2心脏的左心室图谱
04形态功能关联与心律失常机制
通过将二维光学映射数据与三维解剖网格配准，研究人员实现了电活动与纤维化结构的精确叠加。在DSG2心脏中，低频起搏时纤维化区域仍可支持传导，而高频刺激则在这些区域边缘引发传导减慢甚至阻滞。进一步通过额外刺激诱导的早搏实验发现，当刺激间隔短于75 ms时，DSG2心脏更易发生非持续性室性心动过速，且折返波围绕纤维化斑块传播。计算模型模拟表明，仅依靠结构数据（如纤维化分布和细胞取向）无法完全复现高频下的传导异常，必须引入电生理重塑参数（如连接蛋白Cx43的重新分布、钠电流减少）才能解释实验现象。
传导与纤维化分布之间的形态功能相关性
05计算模型验证频率依赖性滤波效应
研究建立了基于单域方程的心室电活动模型，并逐步整合个性化结构数据（如CF/NCF分布、图像导出的纤维取向）。模拟结果显示，单纯的结构模型仅能预测低频传导，而高频异常需归因于纤维化区域的电生理改变：Cx43在纤维化边缘呈点状分布，增强了心肌细胞与非肌细胞（如成纤维细胞）的电耦合，从而形成低通滤波器效应。一维链式模型进一步证明，成纤维细胞插入会降低动作电位上升速率（dV/dt）和传导速度，且该效应随刺激频率增加而加剧。这一机制阐明了纤维化如何通过改变局部电路属性，而非单纯阻断传导，来促发心律失常。
额外电刺激期间纤维化对传导和心律失常发生的影响
动作电位传导的综合计算建模
解析整个心脏中的细胞定向
创新与亮点
本研究的核心创新在于突破了传统成像技术的局限，实现了全器官水平的功能-结构一体化分析。它解决了以下关键难题：首先，传统方法难以在保持样本完整性的同时获取微米级三维数据，而光片显微镜结合SHIELD透明化技术实现了整个小鼠心室的高通量成像，避免了切片带来的信息损失；其次，通过开发自动配准算法，将表面光学映射数据映射至三维网格，克服了二维数据与三维结构对接的挑战。
在技术层面，论文提出并优化了一套多模态光学成像流程：从活体电生理记录到固定样本的透明化处理，再到光片显微镜的全心室扫描，最终通过计算模型进行功能验证。其中，散射信号作为胶原纤维的代理指标，无需免疫标记即可量化纤维化，这不仅简化了流程，还提高了重现性。此外，图像导出的纤维取向映射技术（空间分辨率96 μm）为模拟提供了更真实的各向异性传导参数。
在生物医学应用方面，该技术为心律失常研究提供了新范式。通过揭示纤维化区域的低通滤波特性，它解释了为何某些患者在静息时心电图正常，而运动或应激状态下易发心律失常。这一发现有望推动个性化心脏模型的构建，在基因治疗或药物筛选中预测干预效果。
总结与展望
本论文通过整合光学映射、组织透明化和光片显微镜技术，首次在全器官尺度上揭示了纤维化心肌的频率依赖性电传导机制。研究证实，纤维化区域通过改变细胞间耦合和离子通道属性，形成低通滤波器，从而在高频刺激下促发心律失常。这一发现不仅深化了对致心律失常性心肌病的病理理解，还强调了多模态成像在心脏电生理研究中的核心价值。展望未来，该技术框架可进一步与全景光学映射系统结合，以捕捉双心室电活动动态；同时，通过引入钙信号同步记录或基因编辑模型，有望解析更多分子机制。长远来看，这类高分辨率功能-结构数据将推动数字心脏模型的发展，为个性化心律失常风险评估和精准治疗策略提供坚实基石。
声明：本文仅用作学术目的。
Giardini F, Olianti C, Marchal GA, Campos F, Romanelli V, Steyer J, Madl J, Piersanti R, Arecchi G, Perumal Vanaja I, Biasci V, Rog-Zielinska EA, Nesi G, Loew LM, Cerbai E, Chelko SP, Regazzoni F, Loewe A, Bishop MJ, Mongillo M, Kohl P, Zaglia T, Zgierski-Johnston CM, Sacconi L. Correlative imaging integrates electrophysiology with three-dimensional murine heart reconstruction to reveal electrical coupling between cell types. Nat Cardiovasc Res. 2025 Nov;4(11):1466-1486.
DOI:10.1038/s44161-025-00728-9.