三光子激发技术在蓝光荧光团成像中的应用
2026-01-16 来源:本站 点击次数:132本论文核心内容为演示一种同时利用双光子和三光子激发的新型显微成像技术，用于对细菌群落的固有荧光进行深度、无标记成像。研究团队通过超快镱（Yb）光纤激光放大器，以单一波长（1040纳米）激发样品，实现了活体细菌群落的多色成像。三光子激发技术在蓝光荧光团成像中表现出色，能有效克服高散射样品中的光散射和离焦光漂白问题，成像深度可达800微米以上，为微生物群落的结构和功能研究提供了非侵入性工具。
本论文的重要发现者为Alma Fernández、Anton Classen、Nityakalyani Josyula、James T. Florence、Alexei V. Sokolov、Marlan O. Scully、Paul Straight和Aart J. Verhoef。论文题为“Simultaneous Two- and Three-Photon Deep Imaging of Autofluorescence in Bacterial Communities”，发表在学术期刊《Sensors》。
重要发现
01实验系统设计与成像原理
论文的核心贡献在于开发了一套基于超快光纤激光器的多光子成像系统，用于对链霉菌（Streptomyces）细菌群落的固有荧光进行深度成像。实验系统采用自建的 monolithic Yb光纤激光器，其输出波长为1040纳米，脉冲持续时间约180飞秒，重复频率可调（本实验使用4.17兆赫兹），脉冲能量最高达400纳焦耳。激光束通过光栅压缩器补偿色散后，由25倍、数值孔径1.05的物镜聚焦到样品上，荧光信号通过非解扫描检测方式收集，并分三个光谱通道：蓝色（400-480纳米，对应三光子激发）、绿色（490-560纳米，混合激发）和红色（570-640纳米，对应双光子激发）。该系统的关键优势在于单一光源即可同时激发双光子和三光子过程，无需复杂的光参量放大装置，降低了设备复杂度。
实验使用 Streptomyces aizunensis NRRL B-11277 菌株，在液体培养基中培养48小时后，通过离心获得菌体沉淀，并制备不同厚度的样品（薄样品约30微米，厚样品可达1毫米以上）。样品的散射长度通过调节水分含量控制在80微米（高密度）至170微米（低密度）之间，以模拟真实生物环境中的散射效应。通过功率依赖性实验，研究人员验证了各通道的荧光激发机制：蓝色通道信号与激发功率的三次方成正比（S∝P^3.09），确认为三光子激发；红色通道信号与功率平方成正比（S∝P^1.96），属于双光子激发；绿色通道则显示混合特性（S∝P^2.81），表明可能存在多种荧光团或同一荧光团的多路径激发。这种分光特性使得系统能够同时捕获细菌群落中不同代谢物的空间分布。
03深度成像性能与信噪比分析
在深度成像实验中，论文重点比较了双光子和三光子成像在高散射样品中的表现。对于散射长度为170微米的低密度样品，三光子激发的蓝色荧光在570微米深度处仍保持信噪比高于10:1，而双光子激发的红色荧光在550微米深度时信噪比已降至1:1.5。在高密度样品（散射长度80微米）中，三光子成像在270微米深度处的信噪比可达10:1以上，而双光子成像在相同深度下信噪比已低于3:1。通过点扩散函数测量和模拟计算，研究证实三光子激发具有更强的轴向限制能力，能显著抑制焦外背景荧光，从而在深层组织中保持优异的成像对比度。
04最大成像深度验证
在中等密度样品（散射长度120微米）的极限测试中，研究团队成功实现了780微米深度的三光子成像。此时蓝色通道仍能清晰分辨链霉菌丝状结构，而红色通道的图像因背景噪声过强已无法识别细节。这一深度相当于6.5个有效衰减长度，突破了传统共聚焦显微镜在紫外-蓝光波段的成像极限。
创新与亮点
01突破蓝光荧光团深层成像难题
论文首次解决了细菌群落中蓝光区域固有荧光团的深层成像挑战。传统共聚焦显微镜使用紫外或深蓝光激发时，会遭遇强烈的组织散射和吸收，且易引起样品光损伤。三光子激发通过长波长（1040纳米）红外光实现等效于紫外波段（约347纳米）的激发，显著降低散射损耗，使成像深度提升至传统方法的5倍以上。这一突破使得研究人员无需对样品进行切片处理即可观察细菌群落内部结构，为活体微生物研究提供了重要技术支撑。
研究团队创新性地实现了单一激光源同时激发双光子和三光子过程的技术方案。通过精确控制光纤激光器的脉冲特性（180飞秒脉冲宽度、4.17兆赫兹重复频率），在1040纳米波长下同步激活不同能级跃迁。该设计避免了复杂的光参量放大系统，降低了设备成本和维护难度。检测系统采用多波段分光策略，配合时间门控技术，有效分离不同非线性过程的信号，确保多色成像的准确性和稳定性。
03在微生物研究领域的应用价值
该技术在微生物生态学研究中展现出巨大潜力。例如，在链霉菌代谢产物分布分析中，三光子成像可无标记追踪抗生素合成过程中的空间动态；在生物膜形成机制研究中，能长期监测胞外聚合物分泌的三维结构变化；在微生物互作研究中，可实现多菌种共培养体系的实时观测。相较于需要基因编辑或外源染色的方法，这种无标记成像技术最大程度保持样品自然状态，为微生物学研究提供更真实的实验数据。
总结与展望
本研究成功开发了基于超快光纤激光器的双光子、三光子同步成像技术，实现了对细菌群落固有荧光的深度、无标记观测。通过系统验证，三光子激发在蓝光荧光团成像中展现出显著优势，特别是在高散射样品中能维持优异信噪比，成像深度可达800微米。该技术为微生物群落结构分析和代谢过程研究提供了强大工具。
未来研究方向包括进一步提升成像速度以实现动态过程捕捉，拓展光谱检测范围以覆盖更多内源荧光团，以及开发便携式设备用于野外微生物样本快速检测。随着激光技术的持续发展，多光子成像有望成为微生物学研究的标准手段，为环境微生物、医学病原体和工业菌株等领域提供更深入的观测能力。
论文信息声明：本文仅用作学术目的。
Fernández A, Classen A, Josyula N, Florence JT, Sokolov AV, Scully MO, Straight P, Verhoef AJ. Simultaneous Two- and Three-Photon Deep Imaging of Autofluorescence in Bacterial Communities. Sensors (Basel). 2024 Jan 20;24(2):667.
DOI:10.3390/s24020667.