ELISA 实验中常见的非特异性结合问题大盘点
2026-01-14 来源:本站 点击次数:186
ELISA实验中常见的非特异性结合问题主要包括以下几类：
操作细节问题
洗涤不充分：未结合的酶标抗体或样本杂质残留，导致背景值升高。
孵育时间过长或抗体浓度过高：可能导致非特异性结合增加。
加样误差：移液器未校准、加样时间不一致等，导致重复性差。
试剂选择错误
抗体交叉反应：一抗/二抗浓度过高或特异性不足，导致非特异性结合。
封闭不充分：封闭剂选择不当或封闭时间不足，导致非特异性结合位点未被饱和。
设备维护不足
洗板机故障：针头堵塞或未校准，导致洗涤不彻底。
酶标仪误差：滤光片不匹配或参数设定不正确，导致读数偏差。
样本处理不当
溶血：红细胞释放的亚铁血红素具有类过氧化物酶活性，会催化底物显色导致假阳性。
细菌污染：细菌内源性酶（如辣根过氧化物酶）可催化底物产生非特异性显色。
样本处理不当：抗凝不完全导致纤维蛋白残留，洗涤不彻底时酶残留引起假阳性。
其他干扰因素
内源性干扰物质：如类风湿因子（RF）、补体、嗜异性抗体等，可与固相抗体或酶标二抗的Fc段结合，导致假阳性。
外源性干扰因素：如抗凝剂干扰（肝素抗凝血浆增加OD值，EDTA或NaN₃抑制酶活性）。
通过优化样本处理、规范操作、选择高质量试剂和维护设备，可有效减少非特异性结合，提高实验结果的准确性和可靠性。
操作细节问题
洗涤不充分：未结合的酶标抗体或样本杂质残留，导致背景值升高。
孵育时间过长或抗体浓度过高：可能导致非特异性结合增加。
加样误差：移液器未校准、加样时间不一致等，导致重复性差。
试剂选择错误
抗体交叉反应：一抗/二抗浓度过高或特异性不足，导致非特异性结合。
封闭不充分：封闭剂选择不当或封闭时间不足，导致非特异性结合位点未被饱和。
设备维护不足
洗板机故障：针头堵塞或未校准，导致洗涤不彻底。
酶标仪误差：滤光片不匹配或参数设定不正确，导致读数偏差。
样本处理不当
溶血：红细胞释放的亚铁血红素具有类过氧化物酶活性，会催化底物显色导致假阳性。
细菌污染：细菌内源性酶（如辣根过氧化物酶）可催化底物产生非特异性显色。
样本处理不当：抗凝不完全导致纤维蛋白残留，洗涤不彻底时酶残留引起假阳性。
其他干扰因素
内源性干扰物质：如类风湿因子（RF）、补体、嗜异性抗体等，可与固相抗体或酶标二抗的Fc段结合，导致假阳性。
外源性干扰因素：如抗凝剂干扰（肝素抗凝血浆增加OD值，EDTA或NaN₃抑制酶活性）。
通过优化样本处理、规范操作、选择高质量试剂和维护设备，可有效减少非特异性结合，提高实验结果的准确性和可靠性。
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