本文核心要点速览：

1. 死菌DNA会导致支原体核酸检测的LOD虚假偏低
2. 菌株的GC/CFU比值是评估其质量的核心指标
3. 方法验证必须使用经过标定的菌株

在基于核酸扩增技术（NAT）的支原体检测中，检测限（LOD）常被视作方法灵敏度的核心指标。然而，在实际的方法学验证与应用中，一个常被忽视的问题是：

LOD的可靠性首先取决于支原体菌株的质量。

支原体检测qPCR扩增

01 NAT检测的本质：检测支原体核酸
与培养法不同，NAT方法直接检测支原体DNA信号，这意味着：
✦ NAT无法区分活菌与死菌
✦ 检测结果高度依赖样品中的基因拷贝数（GC）
 

dPCR检测支原体GC

对于支原体菌株，行业通用的生物学定量单位是菌落形成单位（CFU），关键在于，GC与CFU之间并不存在恒定比例关系。
 

 
支原体固体平皿培养

02 GC/CFU比值：影响LOD的关键但隐蔽因素
在支原体菌株制备过程中，常面临以下挑战：

支原体液体培养

• 支原体易聚集，难以均匀分散。
• 不同种类支原体培养条件差异大，工艺复杂。
• 支原体个体微小，不易直接观察计数。
• 培养过程中容易产生死菌。
• 死菌会释放游离DNA，显著抬高GC含量。

当GC/CFU比值过高时：

• LOD在数据上看似更低。
• 实际检测信号可能主要来源于死菌核酸。
• 对于核酸检测而言，高浓度的检测对于检测体系要求反而更低。
• 导致核酸法灵敏度被“虚假放大”。

03 行业共识：并非所有菌株都适合用于LOD验证
当前行业普遍认同：

• ATCC提供的标准支原体菌株在一致性和可追溯性方面更具优势。
• 多数合格菌株的GC/CFU比通常控制在10以下（除非另有说明）。
• 应选择适用于NAT方法LOD验证和方法学确认的菌株。

EP 2.6.7草案（Pharmeuropa 36.1）对于菌株的要求：

• 支原体应在生长的指数阶段收获，以保证菌株活性。
• 应在冻存工作悬浮液/稀释液之前测定CFU。
• CFU的测定应进行一定数量的重复。
• 对于基因组拷贝数(GC)的测定，必须同时考虑上清和细胞这两种组分。
• 确定GC/CFU比值的接受标准：除非另有说明，否则参考品的GC/CFU比值应小于10。