组织透明化联合多光子显微镜技实现1毫米肌肉样本高分辨率三维成像
2026-01-22 来源:本站 点击次数:26本研究针对杜氏肌营养不良症（DMD）这一严重影响肌肉功能的遗传性疾病，开发了一种创新的三维成像与分析方法，旨在深入揭示病变骨骼肌中血管网络与纤维化组织的复杂空间重构。传统二维组织学分析难以全面捕捉肌肉组织中血管、肌纤维和胶原网络之间的立体交互关系，而本研究通过整合多光子显微镜技术（包括二次谐波发生和双光子激发荧光）与组织透明化方法，成功实现了对厚肌样本的高分辨率三维成像，并结合深度学习算法进行定量分析，为理解DMD病理机制提供了全新的视角。
本研究成果由Ibrahim Hassani、Mireille Ledevin、Chantal Thorin、Tony Fiore、Marie-Anne Colle、Karl Rouger及Laurence Dubreil共同完成，以题为“Multiphoton microscopy and tissue clearing for 3D characterization of the vasculature and fibrosis remodeling in rat dystrophic skeletal muscle”的论文形式，于2025年10月发表于《Scientific Reports》期刊平台。
重要发现
01血管网络在肌营养不良肌肉中发生显著三维重构
本研究通过对1岁龄野生型（WT）与肌营养不良（DMDmdx）大鼠的股二头肌样本进行系统比较，揭示了病变肌肉中微血管系统的深刻空间重组。在传统的二维分析中，尽管微血管密度等全局参数在两组间未显示出显著差异，但一个称为“共享因子”的指标——即单个微血管所服务的肌纤维数量——在DMDmdx大鼠中显著升高，暗示了血管资源分配的异常。
然而，当研究转入三维层面，更复杂的图景才得以展现。借助组织透明化技术（结合iDISCO+和CUBIC协议），研究人员能够对厚达1毫米的肌肉样本进行成像，穿透深度远超传统显微镜的极限（约150微米）。通过双光子激发荧光（TPEF）对凝集素标记的血管进行成像，并结合深度学习模型（如U-Net架构的Segment.ai模块）对血管网络进行自动分割和三维重建，研究发现DMDmdx肌肉中的血管网络呈现出高度的无序性：与野生型肌肉中平行于肌纤维的规则走向不同，病变肌肉中的血管分支杂乱无章。定量分析进一步证实，DMDmdx肌肉中的血管分支数量显著增加，而单个微血管的长度显著缩短，直径也略有减小。尤为关键的是，血管与肌纤维之间的接触表面积在病变肌肉中大幅减少，这表明营养物质和氧气交换的关键界面受到了严重损害。
02纤维化重塑与血管包裹现象在三维视角下凸显纤维化，即胶原蛋白等细胞外基质的过度沉积，是DMD的另一个核心病理特征。本研究利用二次谐波发生（SHG）成像技术，无需染色即可特异性地对富含胶原的纤维化结构进行三维可视化。分析结果显示，DMDmdx肌肉中的内膜胶原网络密度相比野生型肌肉出现了极显著的增加。不仅如此，胶原网络的形态也发生了改变：胶原物体分布更为密集，其形状也更不规则的伸长。
通过将血管（TPEF信号）和胶原（SHG信号）的三维图像进行空间叠加分析，研究取得了关键发现：在DMDmdx肌肉中，有高达10.07%的微血管体积被胶原网络所包裹，而在野生型肌肉中这一比例仅为1.79%。
这种“血管被纤维化组织包裹”的现象，直观地展示了纤维化如何从物理空间上隔离血管与肌纤维，很可能加剧了血管功能障碍和肌肉缺血，从而形成一个恶性的病理循环。
03深度学习赋能的高通量三维形态定量分析本研究的技术核心之一在于建立了一套自动化的三维图像分析流程。面对三维图像数据中庞大而复杂的结构信息，研究人员训练了专门的深度学习模型来精确分割肌纤维和微血管。这些模型在准确率（Precision）、召回率（Recall）等指标上均表现出色，实现了对血管密度、分支数量、接触表面积以及胶原网络体积、形态、分布距离等多种关键参数的高通量、可重复性定量。这种方法不仅大大提高了分析效率，也减少了人为偏差，使得从复杂三维结构中提取可靠生物学信息成为可能。
创新与亮点
本研究的首要创新点在于成功突破了传统二维组织学在分析复杂三维生物结构时的局限。它通过将多光子显微镜（SHG/TPEF）与先进的组织透明化技术（iDISCO+/CUBIC）有机融合，构建了一套能够对不透明、高散射的病理肌肉组织进行深度（可达1毫米）、高对比度、多参数同步成像的技术体系。这一技术组合有效克服了光在生物组织中散射导致的成像深度浅、图像质量差的核心难题。
其次，该研究提出并验证了一种基于深度学习的三维图像分析新策略。相较于依赖人工判读或简单阈值分割的传统方法，这种智能化的分割与量化流程能够更精准地捕捉到诸如血管网络细微分支、胶原纤维复杂形态等亚结构特征，从而揭示出在二维切片中根本无法观测到的空间关系变化，例如血管被胶原网络包裹的程度。
在光学生物医疗领域的实际价值方面，这套“成像-透明-分析”一体化技术方案展现出了巨大的应用潜力。它不仅为DMD等肌肉疾病的基础研究提供了前所未有的细节洞察，帮助科学家更全面地理解疾病进展中血管退化与纤维化加剧之间的相互作用机制，更重要的是，它为未来开发针对血管生成和抗纤维化的治疗策略提供了一个强大的药效评估平台。在临床前研究中，利用该技术可以无创、定量地监测药物治疗后肌肉微环境的三维结构改善情况，从而加速新疗法的开发与优化进程。
总结与展望
本研究通过发展并应用一种结合多光子显微镜、组织透明化和深度学习分析的三维成像技术，清晰地揭示了肌营养不良骨骼肌中血管网络的高度无序、分支增多以及与肌纤维接触减少的特征，同时定量证实了纤维化组织显著增加并包裹血管的空间现象。这些发现强调了血管功能异常与纤维化进程在DMD病理中的紧密关联，为理解该疾病提供了新的三维结构证据。
论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Hassani I, Ledevin M, Thorin C, Fiore T, Colle MA, Rouger K, Dubreil L. Multiphoton microscopy and tissue clearing for 3D characterization of the vasculature and fibrosis remodeling in rat dystrophic skeletal muscle. Sci Rep. 2025 Oct 21;15(1):36686.
DOI:10.1038/s41598-025-20335-9.