本文要点：双锁探针因其增强的特异性和多重检测能力，在医学诊断和药物筛选中具有极高应用前景。然而，目前用于双锁系统的大多数近红外（NIR）荧光团在NIR窗口的蓝区（650–800 nm）表现出光谱活性，严重限制了其在深层组织成像中的应用。在此，首次报道了一类新型深NIR至NIR-II半花青荧光团（Guilin，GL）骨架，其具备双光学校准位点，适用于双锁探针的开发。这些GL染料通过氯取代的花青/半花青杂化获得，发射波长覆盖800–950 nm，并含有关键的meso-Cl及羟基/氨基基团，可便捷地转化为两个不同的反应位点，用于多重成像分析。为验证GL染料的适用性，研究者设计了一种新型双锁探针GL-Cys，其在低半胱氨酸（Cys）浓度下于830 nm处表现出增强发射，而在高浓度下则出现显著的765 nm信号升高。更重要的是，GL-Cys探针可通过体内双通道比率成像，有效区分胰腺/乳腺癌模型及相应肿瘤铁死亡模型中的Cys水平差异。因此，这一分子设计范式建立了一种通用的深NIR至NIR-II半花青骨架，可推广用于其他分析物的多路成像。

方案1. 创新型深近红外到近红外二区半花菁荧光团库，具有双光学可调位点，用于双锁定探针的开发

本研究首次引入一系列创新的深NIR至NIR-II半花青荧光团（命名为Guilin，GL），其整合了双光学校准位点，为双锁探针的开发建立了一个通用平台（方案1）。所设计的GL染料通过经典的氯取代花青/半花青杂化方法，发射波长范围为800–950 nm，并含有关键的meso-Cl及羟基/氨基官能团，可实现多重成像分析。基于这些荧光团骨架，研究者构建了一种新型双锁探针GL-Cys，其光谱响应随半胱氨酸（Cys）浓度变化而切换：在低Cys浓度下于830 nm处表现出增强发射，而在高Cys浓度下则出现765 nm信号的显著升高。至关重要的是，GL-Cys探针能够有效区分胰腺/乳腺癌小鼠模型及相应肿瘤铁死亡模型中的Cys水平差异，凸显了GL荧光团在多重生物分析应用中的潜力。

图1 . GL的合成路线、荧光光谱和DFT计算

杂化通常是赋予荧光团互补性和多功能性的关键分子工程策略。为了获得具有双光学校准位点的深NIR至NIR-II荧光团，研究者尝试将氯取代的花青与半花青进行杂化，从而产生一类新型的NIR染料（GL-1–8），其含有氯和羟基/氨基光学校准基团。GL-1–8染料通过经典的半花青合成方法以良好产率合成，本研究中使用的GL-1–8合成路线如图1a所示。所有化合物均通过核磁共振（NMR）光谱（1H和13C）和高分辨率质谱进行了验证。

接下来，本文测定了GL-1–8在不同溶剂（包括CH₂Cl₂、CH₃OH、MeCN和MeCN/PBS（1:1（v/v）；pH=7.4））中的光物理性质。GL-1–8染料在MeOH中的最大吸收峰分别位于766、799、780、824、753、764、853和869 nm。相应地，这些染料在深NIR和NIR-II区域也表现出强荧光，最大发射峰分别位于825、827、832、839、920、923、927和936 nm，表明其在深层组织成像中的潜力（图1b和c）。为了提供理解不同供体和受体对光谱位移影响的理论基础。密度泛函理论（DFT）计算显示，GL-1–8的能隙从2.047 eV逐渐减小到1.759 eV，与实验光谱数据吻合良好（图1f）。

为了支持GL-1–8染料具有双光学校准位点的设计概念，研究者分别验证了meso-Cl和羟基/氨基官能团的光学调谐能力。首先，将这些染料置于一系列pH水平下，以模拟酚类化合物的质子化和去质子化。如预期，GL-1–6（图1d、e和S4）在不同pH条件下的发射光谱表现出以λ=820–940 nm为中心的荧光带增加，以及以λ=740–860 nm为中心的荧光带减少。此外，吸收光谱也显示出pH诱导的波长位移。

方案2 . 用于肿瘤小鼠模型和相应肿瘤铁死亡模型中半胱氨酸（Cys）水平双通道区分的双锁荧光探针示意图。

图2. GL-Cys检测不同Cys浓度的研究

为探究GL-Cys区分检测半胱氨酸（Cys）的可行性，评估了GL-Cys与Cys反应过程中吸收光谱的变化（图2）。当加入低浓度Cys（0–60 μM）时，GL-Cys溶液在610 nm处的吸光度逐渐降低；随后，在810 nm处出现新的吸收带，在830 nm处出现新的发射带，溶液颜色由蓝色逐渐变为绿色（图2a和c）。值得注意的是，过量Cys的加入导致吸收光谱发生显著蓝移，从810 nm移至645 nm，同时溶液颜色由绿色变为青绿色。在Cys浓度60–350 μM范围内，765 nm处的荧光强度逐步增强（图2d）。值得注意的是，GL-Cys的荧光强度与Cys浓度（0–10 μM）之间呈现显著线性相关性。基于荧光光谱，GL-Cys对Cys的检测限（3σ/k）约为31.3 nM（图2e）。为验证探针在复杂生物基质中的适用性，开展了选择性实验以评估GL-Cys对多种活性物质的响应。在通道1（λem = 830 nm）中，仅Cys引起荧光强度7.8倍的增强，而其他物质如活性硫/氧/氮物种、氨基酸、阳离子和阴离子均未引起显著荧光增强（图2f）。同样，在通道2（λem = 765 nm）中，仅Cys的加入导致荧光强度12.7倍的提升（图2g）。这些结果表明，GL-Cys对Cys的选择性显著高于其他测试的生物物种，适用于生物体系中特异性的双通道Cys识别与高保真成像。

图3. 不同预处理条件下PANC-1细胞和4T1细胞中GL-Cys的共聚焦成像

PANC-1细胞和4T1细胞与GL-Cys共孵育，以验证该探针有效区分不同Cys水平的能力。如图3a、b、e和f所示，内源性Cys触发了细胞内的红色荧光发射。当PANC-1和4T1细胞在与GL-Cys孵育前，先用生物硫醇清除剂N-乙基马来酰亚胺（NEM）预处理30 min时，红色荧光显著减弱，表明细胞内Cys水平降低；相反，若细胞先用半胱氨酸供体N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）预处理30 min，再与GL-Cys孵育，则红色荧光显著增强，表明NAC补充有效提升了细胞内Cys浓度。综上，这些结果表明GL-Cys探针能够精确检测细胞内Cys浓度的升高与降低。

半胱氨酸（Cys）是评估恶性肿瘤严重程度，尤其是胰腺癌的重要生物标志物，肿瘤铁死亡的发生也与Cys水平密切相关。 Erastin是一种细胞渗透性铁死亡激活剂，被广泛认为是诱导铁死亡的有效试剂。因此，进一步研究了GL-Cys探针在追踪铁死亡过程中Cys水平动态变化中的适用性。PANC-1和4T1细胞先与erastin预孵育8 h，再与GL-Cys孵育30 min，结果观察到红色通道荧光强度降低。Fer-1可缓解erastin诱导的胞质和脂质中活性氧的积累。随后，PANC-1和4T1细胞先与erastin孵育8 h，再用Fer-1处理2 h，最后与GL-Cys孵育30 min。与仅用erastin处理的细胞相比，同时使用erastin和Fer-1处理的细胞红色通道荧光信号略有增强（图3c、d、g和h），表明铁死亡细胞模型中Cys水平升高。此外，流式细胞术分析结果进一步验证了上述发现（图3i和j）。这些结果表明，GL-Cys能够有效监测肿瘤细胞铁死亡过程中Cys水平的动态变化。

图4. GL-Cys的体内双通道荧光成像

研究者在正常小鼠和胰腺癌小鼠中系统评估了GL-Cys的体内双通道荧光成像能力。如图4所示，GL-Cys通过皮内注射给予两组正常小鼠（第1组：NEM预处理；第2组：仅注射探针）。图4e显示，与第2组相比，第1组注射区域的荧光信号显著降低，通道1仅呈现微弱荧光，通道2无可检测信号，表明该双锁探针GL-Cys能够通过两个通道的荧光信号有效区分不同Cys水平。

为评估GL-Cys在肿瘤小鼠中的成像效能，研究者建立了皮下胰腺肿瘤模型，并在相同时间窗口内观察皮下注射探针后双通道荧光的变化（图4a）。胰腺肿瘤小鼠被分为六组。如图4e所示，与第2组相比，第3组在通道1的荧光信号略有增强，而在通道2中，荧光强度从约0.52 ± 0.02升高至1.0 ± 0.02，表明胰腺癌小鼠体内的Cys水平显著高于正常小鼠。对胰腺肿瘤小鼠施用NEM（第4组）后，双通道信号均下降至第2组水平（图4h和i）。GL-Cys在体内可视化胰腺肿瘤模型及肿瘤铁死亡模型中Cys水平差异的能力进一步得到验证。

在肿瘤经erastin预处理48 h后（第5组），皮下注射GL-Cys导致通道1的荧光信号较第3组略有降低，而通道2的荧光强度则从约1 ± 0.02显著下降至0.65 ± 0.03（图4i），表明小鼠胰腺癌铁死亡过程中Cys水平显著下调。此外，当肿瘤先经erastin预处理48 h，再经Fer-1处理8 h后注射GL-Cys（第6组），通道1和通道2的荧光强度较第5组均略有回升。

图5. 乳腺癌小鼠模型中探针GL-Cys的体内双通道成像

受GL-Cys在胰腺肿瘤模型中优异表现的启发，研究者进一步将该探针应用于乳腺癌肿瘤模型中Cys的双通道荧光成像。采用BALB/c裸鼠建立皮下乳腺肿瘤模型，并将小鼠分为四组（第1组：肿瘤小鼠 + GL-Cys；第2组：肿瘤小鼠 + NEM + GL-Cys；第3组：肿瘤小鼠 + erastin + GL-Cys；第4组：肿瘤小鼠 + erastin + Fer-1 + GL-Cys）（图5a）。与第1组相比，第2组的双通道荧光强度在0至30 min内逐渐降低（图5b），表明NEM诱导使4T1肿瘤内Cys水平下调。在4T1铁死亡诱导组（第3组）中，与第1组肿瘤小鼠相比，通道1（2.12 ± 0.03降至1.25 ± 0.02）和通道2（4.12 ± 0.03降至2.75 ± 0.02）的荧光强度均显著下降，表明在4T1小鼠铁死亡过程中Cys同样被下调（图5c和d）。在第4组中注射铁死亡抑制剂Fer-1后，通道1和通道2的荧光信号均较第3组显著增强（图5c和d）。NIR比率荧光分析（通道2/通道1）亦验证了上述结果（图5e）。为确证铁死亡的发生，对不同处理后的肿瘤组织进行了深入分析，并采用商业试剂盒检测肿瘤中Cys、GSH和MDA的水平。结果显示，Cys和GSH水平均下降，而MDA水平升高（图5f–h），从而确证了erastin诱导的4T1肿瘤铁死亡模型。实验结果表明，GL-Cys可通过体内双通道荧光成像有效区分乳腺癌肿瘤模型与相应肿瘤铁死亡模型中的Cys水平差异，凸显了GL荧光团在多重生物分析中的应用潜力。

本研究成功构建了一类新型深NIR至NIR-II半花青荧光团（GL），其具备双光学校准位点，可用于开发双锁探针。这些GL染料通过氯取代的花青/半花青杂化获得，发射波长覆盖800–950 nm。值得注意的是，这些染料整合了花青与半花青的光学校准位点，其光学性质可通过中间位氯（类似花青染料）和末端氨基/羟基（类似半花青染料）轻松调控，从而显著推动了双锁探针的发展。基于这些荧光团，本文构建了一种智能双锁探针GL-Cys，其在体外对Cys表现出优异的响应性与选择性，并呈现Cys浓度依赖性的光谱切换行为：在低Cys浓度下增强830 nm发射，在高浓度下增强765 nm信号。更重要的是，GL-Cys可通过体内双通道比率荧光成像，有效区分多种肿瘤模型及其相应肿瘤铁死亡模型中的Cys水平差异，凸显了GL荧光团作为多重生物分析通用平台的潜力。因此，GL骨架为开发靶向多种分析物的先进探针提供了坚实基础，可用于深组织中的近红外多色成像，未来研究有望将其应用拓展至更广泛的靶标范围。

参考文献

Liu Q, Li Z, Huang Y, et al. Deep-NIR to NIR-II hemicyanine fluorophore scaffolds with dual optically tunable sites for in vivo multiplexed imaging[J]. Chemical Science, 2025, 16(48): 23394-23404.

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